基于IKKβ/NF-κB信号通路探讨丹紫康膝冲剂对大鼠膝骨关节炎的影响※

唐 琦 董大立

（湖南中医药大学第二附属医院骨伤五科，湖南 长沙 410005）

骨关节炎（osteoarthritis，OA）是一种关节软骨退变，骨质丢失，关节边缘骨质增生，进而形成关节畸形为病理特征的慢性关节疾病，常累及骨质、滑膜、关节囊及关节其它结构，常发于负重较大关节如膝关节、髋关节、脊柱等部位，以膝关节发病率最高[1]。流行病学研究显示[2]，OA多发于老年人，女性患者多于男性，45～64岁人群中患病率为17%～20% ，65岁以上人群达50%，75岁以上人群，约有80%。随着我国人口老龄化加快，使OA患者逐年上升，经临床观察患者膝关节早期主要表现为疼痛，活动受限、局部肿胀，若得不到有效治疗将导致关节周缘严重骨质增生及间隙严重变窄，进而引起膝关节畸形（O型腿或X型腿），关节残疾等不良后果，严重影响患者的生活质量[3]，同时为社会带来了较大的负担。我院拟使用骨伤科名老中医四十年经验方结合现代药物化学合成技术制成丹紫康膝冲剂，探讨丹紫康膝冲剂对NF-κB经典信号通路各重要环节的影响机制，明确其对OA的有效靶点，为丹紫康膝冲剂的临床推广提供理论基础和实验依据。

1 资料与方法

1.1 实验动物及分组 雄性SD大鼠60只，体质量在200～220 g（由湖南中医药大学实验动物中心代购），随机排列表法分丹紫康膝组 （以下简称A组）、双氯芬酸钠组（以下简称B组）、生理盐水组 （以下简称C组）每组20只。

1.2 实验用药 丹紫康膝冲剂：主要成分为紫河车，丹参，熟地，怀牛膝，补骨脂，巴戟天，桑寄生，土鳖，血竭，独活，乳香，白芍。由湖南中医药大学第二附属医院药剂科提供，6 g/包，成人每日剂量18 g；双氯芬酸钠肠溶片（广东华南药业集团有限公司，国药准字H44024989，批号：20150404）。

1.3 动物模型的建立 实验动物购置后予以预喂养1周后，让实验动物适应新环境，对A组、B组、C组大鼠以改良Hulth法[4]造模，术前对大鼠右膝手术侧备皮，并术前12 h禁食，4 h禁水，对动物准确称重后，于腹腔注射10%的水合氯醛0.35 mL/100 g将动物麻醉后仰卧固定于手术台上，对大鼠右膝部予以络合碘消毒3遍，消毒后予以铺无菌巾，无菌条件下取右侧膝关节内侧纵切口长约2 cm，极度屈曲膝关节，使髌骨外翻，暴露膝关节，然后切断前交叉韧带，完整切除内侧半月板，保留关节软骨面，用络合碘和生理盐水交替冲洗伤口2遍，清洗干净手术伤口内血性液体，再用硫酸庆大霉素注射液8万U滴注浸润手术野，防止关节内感染，然后用3-0的慕丝线逐层缝合切口，不包扎，术后不固定患肢，置于标准动物饲养笼中允许其自由活动及进食，术后连续3 d每只手术大鼠予青霉素10万U肌肉注射，连续7 d对大鼠手术伤口予以络合碘早晚消毒2次。

1.4 干预措施 造模成功后，对所有大鼠予逐个电子天平称重，并按编号记录好每只大鼠体重，根据人与动物体表面积换算公式计算各大鼠给药剂量，A组给予丹紫康膝冲剂；B组予以双氯芬酸钠肠溶片，每天2次。

药物干预4周后，用10%水合氯醛0.35 mL/100 g腹腔注射麻醉大鼠，将大鼠固定在鼠板上，术前右膝关节备皮，用剪刀减去右膝关节部位鼠毛，防鼠毛污染标本，断头法用剪刀迅速切断大鼠头部处死动物。大鼠处死后立即切开右膝关节腔，用手术刀剥取股骨内髁及胫骨平台关节软骨，取标本3份用于切取后，置10%甲醛液中固定，用免疫组化法检测IKKβ和Ⅱ型胶原蛋的含量，光镜下观察关节软骨的病理改变。

1.5 观察指标

1.5.1 肉眼下关节大体观察 观察滑膜和软骨表面的颜色、光泽、光滑度 （是否粗糙）。按软骨损伤分级 法将软骨退变程度分级[3]：0级正常：Ⅰ级关节软骨变为黄白色，光泽差，表面仍较平滑；Ⅱ级在Ⅰ级的基础上出现溃疡改变，溃疡未及全层；Ⅲ级软骨全层破 坏，软骨下骨暴露。

1.5.2 关节周径的测量 分别在干预前及干预4周后用无弹性卷尺测量并记录大鼠KOA病理模型膝关节的周径。1.5.3指标的检测 用免疫组化法检测IKKβ、Ⅱ型胶原蛋白含量。

2 结果

2.1 3组大鼠膝关节周径比较 给药前3组间比较，P＞0.05，差异无统计学意义，给药后3组间比较，P＜0.05，差异有统计学意义（见表1）。

表1 丹紫康膝冲剂对大鼠膝关节周径的的影响 （±s，mm）

表1 丹紫康膝冲剂对大鼠膝关节周径的的影响 （±s，mm）

注：与双氯芬酸钠组比较，1）P＞0.05 ，2）P＜0.05；与生理盐水组比较，3）P＜0.05

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2.2 3组大鼠膝关节IKKβ、Ⅱ型胶原蛋白水平比较 见表2。

表2 3组大鼠膝关节IKKβ、Ⅱ型胶原蛋白水平比较 （±s）

表2 3组大鼠膝关节IKKβ、Ⅱ型胶原蛋白水平比较 （±s）

注：与双氯芬酸钠组比较，1）P＞0.05 ，2）P＜0.05；与生理盐水组比较，3）P＜0.05

组别 只数丹紫康膝冲剂组 20 IKKβ干预前 干预后Ⅱ型胶原蛋白干预前 干预后159.74±17.761） 239.74±17.762，3） 61.21±6.221） 69.18±6.032，3）双氯芬酸钠组 20生理盐水组 20 164.97±27.81 199.74±17.763） 62.31±6.32 66.63±6.123）149.09±39.801） 159.74±17.76 61.89±6.321） 62.31±6.32 F值P值1.532 2.282 1.401 2.367 0.15 0.024 0.214 0.031

3 讨论

KOA最主要的病变主要集中在关节软骨和软骨下骨，而其主要病理特征是关节软骨的退变，关节软骨由软骨基质和软骨细胞构成，软骨基质的降解和软骨细胞的减少共同构成关节软骨的退变。丹紫康膝冲剂是我院治疗KOA的经验方，前期临床观察研究结果表明其治疗KOA具有满意的效果[5-6]，本课题的前期研究亦表明丹紫康膝冲剂能改善软骨中含水量，保护软骨基质中的羚脯氨酸，从而防治兔KOA的退变[7]。本实验通过对大鼠膝关节进行改良Hulth方法造成大鼠KOA模型，应用丹紫康膝冲剂对造模大鼠KOA进行干预，从大鼠KOA关节周径比较，给药前3组大鼠的膝关节周径大小无统计学差异（P＞0.05），药物干预后，3组大鼠的膝关节周径大小比较差异有统计学意义（P＜0.05）。说明丹紫康膝冲剂可以减轻大鼠膝关节的肿胀。丹紫康膝冲剂组方合理，兼顾膝关节骨性关节炎的内外病因，既能内补气血肝肾之虚，又能外御风寒湿瘀之邪，全方共奏祛瘀血、补血益气、驱寒胜湿、伸筋止痛之功。

Ⅱ型胶原蛋白是正常透明软骨的特征性胶原，其以网状结构支架的形式维持着正常软骨的生物力学功能及软骨细胞的稳定，在正常的关节软骨中约占90%～95%[10]。近来学者研究表明当骨关节炎软骨退变或炎症信号激时，可使II型胶原蛋白的表达下降，近而致软骨基质的降解，导致软骨细胞失去正常的稳定情，因此Ⅱ型胶原是衡量软骨细胞反分化和表型异常的重要依据[8]。Connor[9]以46只Hartley豚鼠KOA模型，研究Ⅱ型胶原蛋白纤维裂解的时间过程，结果提示在胶原酶裂解和Ⅱ型胶原网络的破坏是在这个模型中OA早期发病的主要原因。Kenneth[13]指出激活的IKKβ转录因子在OA的发病过程中可能被促炎细胞因子，过度的机械应力和ECM的降解产物触发，它也通过调节以上过程，引起软骨细胞分解代谢与合成代谢之间不平衡。IKKβ是NF-κB信号通路的重要组成部分，Lin等[14]指出NF-κB信号通路可在软骨细胞分化过程中，使其逐渐失去Ⅱ型胶原的表达，引起软骨细胞失去力学平衡。本实验中，干预后3组大鼠关节内IKKβ和Ⅱ型胶原蛋白比较，差异有统计学意义（P＜0.05）。说明丹紫康膝冲剂可以通过影响NF-κB经典信号通路中的重要环节，从而治疗OA的有效靶点。