苗药啊咳知的超声提取工艺考察△

范琳琳 伍天苔 王 绘 张 平 何 康

(贵阳中医学院 贵州省苗医药重点实验室，贵州 贵阳 550002)

苗药啊咳知，为水龙骨科 (Polypodiaceae)石韦属(Pyrrosia) 植物庐山石韦 (Pyrrosia sheareri (Bak.) Ching) 的全草。苗药啊咳知在贵州苗族地区用于治疗感染及腹泻，在仡佬族用于抗感染以及在毛南族用于治疗支气管炎等。文献显示庐山石韦中含有绿原酸和芒果这2种有效成分[1,2]，具有抗菌抗炎和抗菌抗病毒等作用，能较典型的反映出该药的主治和功效，且绿原酸为药典的指标性成分。本实验在他人研究成果上进一步探索[3-10]，建立一套科学的提取方案，为其资源的开发与应用提供科学依据。

1 仪器与试药

1.1 仪器 Agilent1100系列高效液相色谱仪(自动进样器，紫外检测器，四元泵：美国，安捷伦公司)，梅特勒-托利多New classic型电子天平(梅特勒-托利多仪器(上海)有限公司)，KQ5200E型超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司)，多功能粉碎机(上海北申科技有限公司)。

1.2 试剂与试药 甲醇为色谱纯(天津市科密欧化学试剂开发中心)；水为二次蒸馏水；绿原酸对照品(购于西南麦克斯药品纯度≥98%，批号140718002)；芒果苷对照品自制，纯度≥98%；庐山石韦药材采自贵州道真，经贵阳中医学院赵俊华教授鉴定为水龙骨科石韦属植物庐山石韦(Pyrrosia sheareri (Bak.)Ching)药材，晒干后用粉碎机将其粉碎，过50目筛，备用；其余试剂均为分析纯。

2 方法与结果

2.1 HPLC法测定绿原酸和芒果苷含量

2.1.1 色谱条件 色谱柱phenomenex-C18(4.6×150mm，5μm)，流动相为乙腈(B)-0.2%磷酸水溶液(C)梯度洗脱，洗脱程序：0～10min，8%B；10～55min，50%B；55～65min，100%B；检测波长为320 nm，流速1.0 mL/min，柱温25℃，进样量10 μL。

2.1.2 对照品溶液的制备 分别取绿原酸、芒果苷对照品1mg，精密称定，置10mL容量瓶中，加甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，即得对照品浓度为0.1 mg/mL。

2.1.3 供试品溶液的制备 精密称定庐山石韦药材粉末0.5000g，加50%甲醇25ml于具塞锥形瓶中，精密称重，超声提取45min，称重，以50%甲醇补足失重，过滤，取续滤液过0.45μL微孔滤膜，即得。

2.1.4 线性关系考察 精密吸取对照品溶液1μL，3μL，5μL，7μL，10μL分别进样，按上述色谱条件测定，以峰面积对进样量进行回归分析。绿原酸的回归方程为Y=2.9599X-4.2246，r=0.9998；芒果苷的回归方程为Y=1.1964X-2.6344，r=0.9996。结果表明呈良好的线性关系。

2.1.5 精密度试验 取同一批供试品溶液，分别按上述色谱条件连续进样5次，测得绿原酸峰面积RSD = 3.04%，芒果苷峰面积RSD = 2.97%，精密度良好。

2.1.6 重复性试验 取同一批庐山石韦进行平行实验6次，约0.5g，精密称定，测得绿原酸平均含量 = 0.7456mg/g，RSD = 2.89%，芒果苷平均含量 = 0.2189mg/g，RSD = 1.43%。结果表明重现性良好。

2.1.7 稳定性试验 取同一批供试品溶液，分别于0h、2h、4h、6h、8h进样，测定绿原酸和芒果苷峰面积值，结果绿原酸平均含量0.7484mg/g，RSD = 0.76%；芒果苷平均含量0.2208mg/g，RSD =1.85%。结果表明稳定性良好。

2.1.8 加样回收率试验 取同一批庐山石韦6份，约0.25g，精密称定，加入一定量的绿原酸和芒果苷对照品，按上述色谱条件测定，计算回收率。结果如表1和表2所示，回收率良好。

表1 绿原酸加样回收实验结果

表2 芒果苷加样回收实验结果

2.2 超声提取工艺考察

2.2.1 乙醇浓度的考察 精密称取0.5000 g庐山石韦粉末，置于50mL三角瓶中，按料液比为1:20 (g/mL)依次加入20、40、60、80、90%浓度的乙醇，在60W功率下超声30 min。以HPLC法测定绿原酸、芒果苷的得率。结果，绿原酸和芒果苷的得率在乙醇浓度40%到80%之间随浓度的升高而先增加后减少，在60%时达到峰值。

2.2.2 超声时间的考察：精密称取0.5000 g庐山石韦粉末，置于50mL三角瓶中，按料液比为1:20 (g/mL) 加入60%浓度的乙醇，60 W功率下分别超声10、20、30、40、50 min。以HPLC法测定绿原酸、芒果苷的得率。结果，芒果苷的得率一直持上升趋势，而当超声时间为30 min时，绿原酸的得率到达峰值。

2.2.3 料液比的考察 取0.5000g庐山石韦粉末，置于50mL三角瓶中，分别按料液比为1:5、1:10、1:20、1:30、1:40(g/mL)依次加入60%浓度的乙醇，60W功率下超声30min。以HPLC法测定绿原酸、芒果苷的得率。结果，当料液比为1:20逐步增大时，绿原酸和芒果苷的得率也不停增加。

2.2.4 超声功率的考察 精密称取0.5000g庐山石韦粉末，置于50mL三角瓶中，按料液比为1:20 (g/mL)加入60%浓度的乙醇，分别选取40、60、80、100 W功率下超声30 min。以HPLC法测定绿原酸、芒果苷的得率。结果，绿原酸在超声功率60W时得率最大，同时超声功率越大，芒果苷的得率越低。

2.2.5 正交试验 在单因素实验的基础上，设计L9(34)正交实验如表3～4所示，结果见表5～6。

直观分析结果表明，各因素对绿原酸得率的影响顺序为A>B>D>C，即乙醇浓度>超声时间>固液比>超声功率；影响芒果苷超声提取得率的顺序为A>D>B=C，即醇浓度>固液比>超声时间=超声功率。方差分析结果表明，各因素对庐山石韦中有效成分绿原酸和芒果苷的影响无显著性差异(P>0.05)。绿原酸最优水平组合为A3B2C1D2，芒果苷最优水平组合为A3B1C1D3或A3B1C2D3。即庐山石韦中绿原酸最优方案为：乙醇浓度为80%，超声时间为30min，超声功率为40W，固液比为1:30 g/mL；芒果苷最优提取方案为：乙醇浓度为80%，超声时间为20min，超声功率为40或80W，固液比为1:40 g/mL。

表3 因素水平表

表4 正交试验表

表5 绿原酸方差分析表

表6 芒果苷方差分析表

3 讨论

如今并没有科研人员对超声提取庐山石韦中绿原酸和芒果苷有效成分进行科学系统实验研究，本实验利用超声提取法快速高效从植物中提取绿原酸和芒果苷。

本实验对庐山石韦中绿原酸和芒果苷的超声提取方法进行了研究和优化，所建立的超声提取方法具有操作简便、结果准确、快速等优点，适用于该植物含量测定的高效快速提取。实验利用指标性成分的提取率，考察了不同乙醇浓度，超声时间，料液比及超声功率对绿原酸和芒果苷得率的影响，摸索出一套合理高效的超声提取方法，即庐山石韦中绿原酸最优方案为：乙醇浓度为80%，超声时间为30min，超声功率为40W，固液比为1:30 g/mL；芒果苷最优提取方案为：乙醇浓度为80%，超声时间为20min，超声功率为40或80W，固液比为1:40 g/mL。

贵州庐山石韦资源较多，提取其有效部位或有效成分可用于临床医疗、食品添加以及美容保健等。一套科学高效的提取方案对其制药和开发具有重大的意义。