蒙药制剂其格日木汤中羟基红花黄色素A含量的测定

2018-11-20杨洋李珍丁华郭慧张烨

中国民族医药杂志 2018年8期

杨洋李珍丁华郭慧张烨

(内蒙古自治区鄂尔多斯市药品医疗器械检验研究中心，内蒙古鄂尔多斯 017000)

其格日木汤由五灵脂、红花、丹参、北五味子、甘草、栀子、川木通、瞿麦、柯子、川楝子、苦地丁、黄连、猪胆粉等13味药组成[1]，本文主要测定方中红花的含量。红花化学成分比较复杂，富含黄色素与红色素，所含的脂肪油俗称为红花油[2]。从红花中分离确定的化学成分主要有含黄酮类物质、脂肪酸、色素、酚酸、挥发油等多种活性成分[3]，其中起活血化淤作用的主要有效成分是红花黄色素，属于醌式查尔酮类化合物，是红花发挥药理作用的物质基础。Meselhy MR 等[4]于1993 年从红花中分离得到的羟基红花黄色素 A ( hydroxysafflor yellow A，HSYA) ，是红花黄色素中含量较高的成分，其含量的多少对红花的药效有着直接影响[5]。中国药典一部从2005年版[6]开始收录并规定以 HYSA为红花中的代表性活性成分进行含量测定。在蒙药制剂其格日木汤含量测定的标准研究过程中，方中红花以HYSA作为测定指标，采用高效液相色谱法测定含量。通过试验摸索，确定了较为理想的色谱条件，经过方法学考察及阴性对照实验，表明该方法简便，重现性好，专属性较强，且方中其他组分对HYSA的测定无干扰，为蒙药制剂其格日木汤中红花成分的定量提供了科学依据。

1 仪器与试药

Waters e2695高效液相色谱仪，PDA检测器；岛津UV-1700型紫外分光光度计；KQ-500DE型数控超声波清洗器。

羟基红花黄色素A对照品(批号：111637-201308；中国食品药品检定研究院)；其格日木汤由本中心蒙研所提供。甲醇、乙腈为色谱纯；水为高纯水；其他试剂均为分析纯。

2 方法与结果

2.1 色谱条件与系统适用性采用Kromasil C18 色谱柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)，以0.7%磷酸溶液(三乙胺调pH值至6.0±0.1)-甲醇-乙腈为流动相，流速1.0 mL·min，柱温40 ℃，进样量10 μL。羟基红花黄色素A峰的理论塔板数均大于3000，与相邻杂质峰的分离度均大于1.5。

2.2 溶液配制

2.2.1 对照品储备液精密称取羟基红花黄色素A对照品1.94 mg，置25 mL容量瓶中，加25%甲醇使溶解，并稀释至刻度，摇匀，制成每1 mL溶液中含羟基红花黄色素A 0.786 mg的溶液，即得。

2.2.2 供试品溶液取其格日木汤样品约1.5 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入25%甲醇50 mL，称定重量，超声处理45 min，放冷，再称定重量，用25%甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过。取续滤液，即得。

2.2.3 阴性对照溶液取按处方比例并以相同工艺制备的缺少红花的阴性对照，按与供试品溶液相同的方法制备阴性对照溶液。

2.3 专属性考察采阴性对照试验。在同一色谱条件下，分别精密吸取对照品溶液、阴性对照溶液、供试品溶液各10 μL，测定液相色谱图，结果阴性对照溶液的色谱图中在与羟基红花黄色素A对照品以及供试品色谱图相对应的保留时间处无色谱峰出现，表明其他组分对羟基红花黄色素A的测定无干扰。

2.4 线性关系考察精密吸取对照品储备液0.5、1、2、3、4、5 mL，分别置5 mL量瓶中，用25%甲醇定容至刻度，摇匀，按2.2项色谱条件进样测定，以峰面积为纵坐标，进样量(μg)为横坐标，经线性回归处理得羟基红花黄色素A回归方程为y=11493x+3211.2 r=0.9996，线性范围为0.776～7.760μg。

2.5 稳定性试验取上述其格日木汤供试品溶液，分别于0、2、4、8、24、32 h进样10 μL，记录峰面积。结果羟基红花黄色素A峰面积的RSD为1.23%，表明供试品溶液在24 h内基本稳定。

表1 不同时间测定样品中羟基红花黄色素A的峰面积

2.6 精密度试验取对照品溶液，连续进样6次，记录羟基红花黄色素A峰面积，计算RSD(n=6)为1.6%，表明仪器精密度良好。

2.7 重复性试验取同一批其格日木汤6份，每份约1.5 g，精密称定，按2.1.2项下方法制备供试溶液，分别进样10 μL，记录峰面积，并计算含量。羟基红花黄色素A的平均含量为1.0596 mg·g-1，RSD为0.90%。表明该方法重复性良好。

表2 羟基红花黄色素A含量重复性试验结果

2.8 加样回收率试验精密称定已测定含量的其格日木汤样品6份(平均含量为1.0596 mg/g)，每份约0.75 g，按2.1.2项下方法制备供试品溶液，各精密加入羟基红花黄色素A对照品储备液 1 mL，按2.3项下方法制备供试溶液，分别进样10 μL，记录峰面积，计算羟基红花黄色素A的量，计算回收率。结果羟基红花黄色素A平均回收率(n=6)为100.9%，RSD=1.41%。表明该方法回收率良好。

表3 羟基红花黄色素A加样回收率试验结果

3 样品含量测定

取3批蒙药制剂其格日木汤，分别按2.1.2项下方法制备供试品溶液，分别进样10 μL，记录羟基红花黄色素A峰面积，采用外标峰面积计算含量。

表4 样品含量测定结果(mg·g-1)

4 讨论

4.1 提取条件的选择羟基红花黄色素A为黄酮类成分，选用25%甲醇作为提取溶剂进行超声溶解提取，比较超声15、30、45和60 min等不同提取时间对提取效率的影响，并测定含量，结果显示超声45 min后供试品溶液中羟基红花黄色素A的含量基本稳定不变，故将提取时间定为超声处理45 min。

4.2 流动相的选择以0.7%磷酸溶液-甲醇-乙腈为流动相为流动相，进行流动相条件摸索，当流动相比例为76:26:2时，样品中的杂质峰分离度小于1.5，调节流动相比例至79:19:2，羟基红花黄色素A峰与其它成分的分离度大于1.5，但是对照品羟基红花黄色素A峰型不对称，加三乙胺调节pH值至6.0时，峰型对称，故将流动相确定为0.7%磷酸溶液(三乙胺调pH值至6.0±0.1)-甲醇-乙腈。

4.3 检测波长的选择取羟基红花黄色素A对照品溶液，于紫外可见光分光光度仪，自200 nm～700 nm做光谱扫描，羟基红花黄色素A在波长403 nm与224 nm处有最大吸收。选择不同波长考察并且对比后发现，对于羟基红花黄色素A在224 nm下的出峰面积无法达到定量要求，为了保证定量准确，结合相关文献[6]选用403 nm作为检测波长，方法学考察表明在该波长下结果稳定、可靠。