高突足襞蛞蝓提取物多糖特征分析及其抗氧化活性研究

刘兆宇 姚文霞 梁 雪

蛞蝓，又名蜒蚰、托胎虫、蛞蜗、鼻涕虫，是最早收载于《本草纲目》的民间用于治疗肺气肿的传统中药，隶属于软体动物门中的腹足纲肺螺亚纲，治疗喘息、喉痹等。高突足襞蛞蝓是蛞蝓品种之一，在我国主要分布南方亚热带及沿海地区，据载尤以广西百色地区的质量最佳。据《本草纲目》等记载蛞蝓可用于治疗喘息、喉痹、痈肿等，现代医学证实其具有降低支气管炎[1]、哮喘[2]、过敏[3]、肺气肿[4]等作用。前期已有报道具有多糖和蛋白特征的高突足襞蛞蝓水提物能通过减少气道粘蛋白表达、减少巨噬细胞侵润等改善COPD小鼠气道炎症[5]。本实验进一步采用高效液相色谱(HPLC)、凝胶渗透色谱(GPC)、气相色谱-质谱对蛞蝓提取物多糖的具体单糖组成、相对分子量大小及相应的抗氧化活性进行研究，为进一步研究蛞蝓药理活性提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

DMEM高糖培养基(GIBCO)；胎牛血清(GIBCO)；青-链霉素双抗(吉诺生物)；SOD活力检测试剂盒(南京建成，A001-3)；CellROX®荧光探针(Thermo, C10443)；葡聚糖标准品(Sigma)；超纯水制备机(MILLIPORE)；养生破壁萃取机(佛山益尔康)；高速冷冻离心机(BECKMAN COULTER)；冷冻干燥机(VirTis)；高效液相色谱仪(Agilent 1260 Infinity，美国安捷伦公司)；色谱柱：TOSOH TSK gel G4000SWXL(300 mm×7.8 mm,10 μm)，TOSOH TSK gel G3000SWXL(300 mm×7.8 mm,5 μm)串联；荧光导致显微镜(Leica, DMi8)。

1.2 实验方法

1.2.1 高突足襞蛞蝓受试物的提取 新鲜速冻蛞蝓全虫1 kg解冻，清洗去除其中的泥沙、杂草等，稍稍控干，用养生破壁萃取机搅碎，2000 r/min低温离心10 min，收集上清液，残渣加ddH2O反复如上操作，最后合并上清液，使终体积为4 L。将最终得到的提取液4℃静置过夜，除脂，冷冻干燥24～48 h，得淡黄色粉末。

1.2.2 受试物的提取放大试验 为检验高突足襞蛞蝓受试物提取工艺的稳定性，按2.1中完整提取工艺，中试三批样品。采用苯酚-硫酸法进行多糖定量、采用BCA法进行蛋白定量测定。

1.2.3 高突足襞蛞蝓受试物脱蛋白处理 制备高突足襞蛞蝓受试物1 mg/mL，向溶液中加入Sevage 试剂(氯仿 ∶正丁醇 =4 ∶1，V/V)200 ml，于水平振荡器中振荡30 min，以4 000 r/min 的速度离心15 min，收集上层水相，重复4次。将得到的溶液冻干，即得蛞蝓脱蛋白受试物。

1.2.4 高突足襞蛞蝓受试物多糖含量、分子量分布及单糖组成的测定 本部分实验委托中国广州分析测试中心进行检测。分别采用气相色谱-质谱(GC-M S)、高效液相色谱(HPLC)分析高突足襞蛞蝓受试物多糖的单糖组成，用凝胶渗透色谱(GPC)分析高突足襞蛞蝓受试物多糖的相对分子量及其分布[6]。

1.2.5 烟草提取物的制备及上皮细胞培养 烟草提取物临用前提取配制。在两个串联的大包氏管内各加入5 mL基础DMEM高糖培养基，然后在串联管的起始端滤头上连接一根剥掉滤嘴的卷烟，在串联管的末端连接一个 50 mL的注射针筒。点燃卷烟后，使用注射针筒以50 mL/10 s的速度抽吸，使烟雾溶于培养基形成气溶胶，每次 2支卷烟，每支卷烟用注射器抽吸 10次。收集培养基，调节其PH值为 7.4，使用 0.22 μm 滤器过滤除菌，得到100%的CSE原液，实验时按需求稀释成不同浓度 CSE。

16HBE细胞用含10%FBS、1%青-链霉素的高糖DMEM培养基培养，待生长至80～90%汇合铺板。细胞实验用相应蛞蝓受试物按照1 mg/mL的浓度用基础DMEM高糖培养基制备，涡旋混合均匀，0.22 μm 滤器过滤除菌，然后分别以1 μg/mL、2 μg/mL、4 μg/mL对16 HBE细胞进行预处理，1%CSE暴露刺激16HBE细胞24 h，诱导氧化应激损伤。

1.2.6 CSE诱导上皮细胞氧化应激及指标检测 采用1%CSE暴露刺激16HBE细胞24 h，诱导上皮细胞氧化应激。分别设置阴性对照处理组(DMEM)、受试物处理对照组1(蛞蝓受试物)、受试物处理对照组2(蛞蝓脱蛋白受试物)、模型处理组(CSE)、模型+受试物处理组1(CSE+蛞蝓受试物)、模型+受试物处理组2(CSE+蛞蝓脱蛋白受试物)，在给予CSE的同时各组给予相应处理。收上清，酶标法检测超氧化物歧化酶(SOD)活力；细胞加入终浓度为5 μm的CellROX®荧光探针，37 ℃孵育30 min，PBS洗3遍，荧光倒置显微镜40倍镜下观察胞质ROS水平。

2 结果与分析

2.1 高突足襞蛞蝓提取物制备及工艺稳定性考察

高突足襞蛞蝓提取物制备流程如图1所示，500 g高突足襞蛞蝓约得到提取物24 g，产率约为6%。接着模拟工业化生产的条件下进行工艺考察，以验证放大生产后原工艺的可行性，保证批次间提取物的质量一致性。结果表明：3批中试样品，成品提率基本一致，多糖提率和蛋白提率基本一致，且批次间标准偏差约4%，确定本品的提取工艺经放大可行，同时比较稳定(见表1)。

图1 高突足襞蛞蝓提取工艺流程

活蝓量/kg成品性状成品量(g)得率(%)多糖量(g)多糖率(%)蛋白量(g)蛋白率(%)150淡黄色9 0606.042 0101.342 5601.71150淡黄色8 9305.952 0101.382 6901.70156淡黄色9 5005.942 2601.412 8301.77

2.2 高突足襞蛞蝓提取物的多糖特征及单糖组成

分别采用气相色谱-质谱(GC-MS)、高效液相色谱(HPLC)分析提取物多糖的单糖组成，结果表明：高突足襞蛞蝓受试物主要含有半乳糖(57.53%)、葡萄糖(17.28%)、甘露糖(9.75%)、果糖(7.12%)、阿拉伯糖(3.44%)、核糖(2.64%)、鼠李糖(2.25%)。脱蛋白处理前后，单糖组成一致(见表2)。采用凝胶渗透色谱(GPC)分析高突足襞蛞蝓相对分子量M r 及其分布，结果表明：蛞蝓受试物多糖的GPC峰的数均相对分子质量(M n) 为1.33×104，重均分子量(Mw)为3.90×105；蛞蝓脱蛋白受试物多糖的GPC 峰的M n 为4.57×103，重均分子量(Mw)为1.40×104。经脱蛋白处理，高突足襞蛞蝓的分子量分布宽度显著减少(见图2，图3)。

表2 高突足襞蛞蝓脱蛋白前后多糖单糖组成特征

图2 高突足襞蛞蝓脱蛋白前后多糖GPC峰图

组成分子量(Molecular weight)数均分子量(Mn)重均分子量(Mw)分布宽(D)高突足襞蛞蝓受试物1.33×1043.90×10529.4高突足襞蛞蝓脱蛋白受试物4.57×1031.40×1043.06

2.3 高突足襞蛞蝓受试物改善CSE诱导的上皮细胞氧化应激

ROS是氧化应激条件下细胞产生的活性氧，直接反应了细胞氧化应激水平；SOD对细胞抗氧化功能起着至关重要的作用，其活性直接反应细胞的抗氧化能力。结果表明，与对照组相比，CSE暴露可诱导16HBE细胞ROS表达增强，SOD水平显著降低；与模型组相比，经高突足襞蛞蝓受试物及高突足襞蛞蝓脱蛋白受试物处理后，16HBE细胞的ROS表达明显降低，相应的SOD水平显著增加(见图3、图4)。

3 讨论

氧化应激损伤是目前认为的慢性阻塞性肺疾病(COPD)的发病机制之一。烟草烟雾常见室内污染物之一，是由上千种化学物质组成的复杂混合物，烟草烟雾暴露能够引起机体呼吸道氧化损伤[7-8]，而气道上皮细胞是组成机体气道屏障的第一防线，会首先出现氧化应激损伤[9]。关于烟草烟雾暴露诱导气道上皮细胞的氧化应激信号通路激活已有报道[10]，正常情况下机体保持自由基生成和清除的动态平衡状态，烟草烟雾暴露会打破这个动态平衡，激活气道上皮细胞产生大量活性氧自由基ROS，机体抗氧化能力(如SOD酶活力)降低，同时引发氧化应激损伤[11-14]。已有报道双线嗜粘液蛞蝓多糖具有抗氧化活性[15]，因此本研究采用烟草烟雾提取物CSE暴露处理16HBE，模拟吸烟所致的气道上皮氧化应激，通过ROS、SOD指标观察高突足襞蛞蝓提取物中多糖组分的抗氧化效果。中药提取物的质量控制是中药药效研究的重要影响因素[16-17]，本研究以多糖和蛋白为主要质量评价指标，通过扩大实验证实高突足襞蛞蝓水提物的提取工艺稳定性，以确保后续实验所用受试样品质量具有较好的一致性，同时也证实了受试物制备工艺稳定性较好，经放大实验仍然能保证受试样品批次间产率无统计学差异，也为后续体外实验奠定了基础。多糖通常是由多种单糖组成，而单糖组成与体外的抗氧化活性有较强的相关性[18]。通过分析高突足襞蛞蝓受试物及高突足襞蛞蝓脱蛋白受试物中多糖的单糖组成、相对分子质量及其分布，发现高突足襞蛞蝓受试物经脱蛋白处理前后，单糖的基本组成并无改变，二者相应的抗氧化效果也较为接近。但是经脱蛋白处理前后的两种足襞蛞蝓受试物，其单糖组成比例有所改变，受试物中关键单糖的所占比例改变，使得原有的改善SOD酶活力的效果更加明显而不依赖于“剂量-效应”关系，因此如果能进一步找到足襞蛞蝓天然多糖组成的关键单糖，势必能够为提高足襞蛞蝓的抗氧化效果提供实验依据。经脱蛋白处理后，受试物的相对分子质量明显变小、分布宽明显变窄提示脱蛋白处理对高突足襞蛞蝓中的多糖含量有一定影响，推测足襞蛞蝓多糖天然状态下可能是与蛋白形成复合结构，因此会受到化学法脱蛋白过程的影响。这与先前报道的双线嗜粘液蛞蝓具有多糖肽链结构较为一致[15]。而足襞蛞蝓脱蛋白受试物的抗氧化效果并未受到化学法脱蛋白过程的影响，反而提高了低剂量受试物的SOD酶活力，提示足襞蛞蝓受试物中抗CSE诱导的气道上皮细胞氧化应激的主要组分是其中的多糖。COPD是一种气道慢性非特异性炎症引发的呼吸疾病，气道的上皮屏障损伤、炎症细胞持续浸润都是引起呼吸道损伤重塑进而导致肺气肿的关键机制[19-20]。本研究中，我们通过观察足襞蛞蝓提取物多糖对气道上皮屏障抗氧化应激的效果，揭示足襞蛞蝓在COPD肺气肿形成初期可能存在潜在的预防保护作用。然而天然多糖具有多种生物学功能，参与细胞生物信息传递、调节机体免疫等[21]。因此，除了抗氧化应激外，足襞蛞蝓提取物多糖是否同时兼具调节免疫作用，抑制肺部及气道炎症，后续还需要进一步研究。

图3 高突足襞蛞蝓受试物及高突足襞蛞蝓脱蛋白受试物处理改善CSE诱导的SOD活性降低

图4 高突足襞蛞蝓受试物及高突足襞蛞蝓脱蛋白受试物处理降低CSE诱导的ROS增加

综上所述，高突足襞蛞蝓的多糖数均相对分子质量(M n) 为1.33×104，重均分子量(Mw)为3.90×105，主要由半乳糖、葡萄糖、甘露糖、果糖、阿拉伯糖、核糖、鼠李糖组成。经脱蛋白处理后，相对分子质量降低，但是单糖组成比例基本不变。高突足襞蛞蝓能降低CSE刺激人气道上皮细胞引起的ROS释放，同时增强SOD酶活力，初步判断其抗氧化组分主要为其中的多糖组分。针对确切的抗氧化应激组分，还需要进一步研究分析。