结直肠癌中RCE1的表达及意义

周 霖 熊 勇 梁 敏 石波云

结直肠癌(Colorectal cancer)是最常见的消化系统恶性肿瘤之一，是世界范围内发病率及死亡率均位居前三的恶性肿瘤[1]。我国结直肠癌发病率呈逐年缓慢上升趋势[2]。TNM分期是判断肿瘤预后和指导治疗的重要依据[3]，II期患者占结直肠癌发病率的30%～40%，但II期结直肠癌患者治疗尚无统一标准且相当一部分患者无法从化疗中获得收益，根治性手术后是否行辅助化疗也存在极大争议[4]。其中仍有20%的II期患者在接收根治性手术后出现肿瘤的远处复发转移[5]。III期患者性根治性手术后常规性辅助化疗，但仍有高达37%患者出现复发[6]。而传统的TNM分期主要依据是患者肿瘤的解剖部位，在决策治疗方式及判断患者预后时存在一定局限性。近年来，肿瘤分子标志物在临床的应用受到了越来越多的关注[7-9]。因此，寻找有效的肿瘤分子标志物作为对TNM系统的补充有助于结直肠癌患者的个体化治疗，对结直肠癌的诊疗具有重要意义。

Ras超家族蛋白参与了细胞的增值、分化、肿瘤形成[10]。越来越多的研究证明Ras蛋白的的持续活化在结直肠癌的发生、发展中发挥着重要作用[11-13]。 Rce(Ras-converting enzyme 1)是一种水解内切酶，主要参与Ras超家族的激活[14]。现有研究证明Rce1与前列腺癌的不良预后相关且可促进肾癌细胞的增殖及侵袭性[15-16]。而Rce1在结直肠癌中的作用尚未清楚。本研究通过免疫组化方法检测结直肠癌患者肿瘤及其匹配癌旁组织中的Rce1表达情况，分析Rce1与患者临床病例参数的关系，探究Rce1在结直肠癌中的表达情况及意义。

1 材料与方法

1.1 研究对象

研究石蜡标本来自广州医科大学附属肿瘤医院2009年1月—2016年11月接受结直肠癌根治术的患者237例，标本包括肿瘤组织和癌旁组织，经病理复查确诊为结直肠癌。其中男91例，女146例。患者的纳入标准为：①根治性术后的患者；②术后病理明确诊断为结直肠腺癌；③患者术前无新辅助化疗、放疗等抗肿瘤治疗，术后高危患者均接收术后辅助化疗；④术后随访资料完全。排除标准：①随访中死于非结直肠癌的患者；②同时或异时伴发其他恶性肿瘤的患者；③围手术期死于严重并发症的患者。

1.2 抗体与主要试剂

兔抗人Rce1单克隆抗体购自Santa Cruz公司；鼠抗人β-action购置Sigma公司；免疫组化试剂盒及显色液购自背景中杉金桥生物公司。

1.3 免疫组化检测

免疫组化检测方法(IHC)。结直肠癌组织标本经甲醛溶液固定，石蜡包埋，连续切片成4 μm厚度；烤箱62 ℃下烘烤2 h后，二甲苯脱蜡、酒精梯度水化后，在3%的过氧化氢溶液中浸泡15 min以消除组织标本中的过氧化物酶，从而减少非特异性染色；继而以0.01 moL/柠檬酸溶液(Ph=6.0)煮沸修复30 min。山羊血清封闭1 h后，滴加Rce1一抗(1 ∶50稀释)，4 ℃过夜；出去一抗用生物素标记的二抗在37 ℃下恒温孵育30 min，DAB显色，苏木精复染，中性树脂封片。同一显微镜以低倍镜观察全片，后随机选取5个高倍镜视野观察染色情况，根据染色程度及染色百分比经行评定，肿瘤染色强度分为：无染色0分，着色淡1分，棕黄色2分，棕褐色3

分；并结合肿瘤染色范围0%～100%综合判定，总分数≤1.5分为阴性，>1.5分为阳性。

1.4 临床病理资料

收集237例结直肠癌患者的完整病理资料，选取了肿瘤浸润深度、病理分级、淋巴结转移、CEA、CA19-9等八项临床病例参数。通过分析Rce1的表达水平与临床病理参数的关系来探讨Rce1在结直肠癌发展中可能发挥的作用。

1.5 统计学分析

2 结果

2.1 Rce1在结直肠癌组织及癌旁组织中表达情况

免疫组化结果显示：Rce1蛋白主要表达于细胞浆，结直肠癌中Rce1表达率为54.9%，明显低于癌旁组织78.9%，Rce1在结直肠癌组织中呈低表达状态(P<0.05；图1D)。

2.2 Rce1蛋白表达与患者预后的关系

低表达Rce1提示不良预后。通过Kaplan-Meier生存分析法分析Rce1表达状态与结直肠癌患者预后的关系。结果如图2所示，高表达Rce1蛋白的患者其5年总体生存率及无瘤生存率均好于Rce1低表达的患者(图2A和B;P<0.05)。因II期和III期结直肠癌患者易早期发生复发转移[17]，我们进一步在这部分患者中分析Rce1表达对预后有无影响，结果显示低表达Rce1的患者易复发且总体生存期较短(图2C和D;P<0.05)。将对结直肠癌患者预后有影响的病理参数与Rce1进行Cox多因素分析。结果显示Rce1可作为结直肠癌患者预后的独立危险因素，差异具有统计学意义(表2；P<0.05)。

A、RCE1 在癌旁正常组织中的表达；B、RCE1在结直肠癌组织中的阳性表达；C、RCE1在结直肠癌组织中的阴性表达； D、条形图显示匹配癌旁组织中RCE1的表达率明显高于癌组织 (P<0.05)

图1 RCE1在结直肠癌组织及匹配癌旁组织中的表达情况

(A)总体生存率；(B) 无瘤生存期；(C)II III期患者总体生存率；(D) II III期患者无瘤生存率

2.3 Rce1与结直肠癌患者临床病理参数分析

从表1中可以看出Rce1表达差异与血液中癌胚抗原(CEA)表达水平、肿瘤浸润深度、有无淋巴结转移、肿瘤分期明显相关，差异具有统计学意义(P<0.05)，与患者性别、年龄、肿瘤分化、糖链抗原19-9(CAA9-9)等无明显相关性(P>0.05)。肿瘤组织中Rce1低表达是结直肠癌患者预后不良因素之一，Rce1可能通过肿瘤的侵袭性引起患者的不良预后。

3 讨论

目前临床TNM肿瘤分期系统是结直肠癌患者选择治疗方式及判断预后的主要依据。虽然根据UICC的TNM分期系统可以使治疗规范化并评估患者的预后，但相同分期的肿瘤患者的预后仍不尽相同[6, 18]。尤其是II和III期的患者，相当一部分术后患者无法从化疗中获得收益[19]。近期研究表明，结直肠癌发生发展的分子机制与肿瘤患者的治疗疗效和预后相关[20]，因此寻找到于此相关的特异性肿瘤标志物有助于患者的精细化治疗。

表2 影响237例结直肠癌患者术后无病生存期和总体生存期的多因素分析

Ras-concerting enzyme 1 (Rce1)为金属蛋白酶家族成员之一。Rce1的主要作用是参与水解末端为CAAX结构的蛋白，如Ras家族蛋白、核纤层蛋白、和一些磷酸化酶与激酶等。这些蛋白参与了细胞的增殖、分化和肿瘤形成[21]。而RAS蛋白作为典型的含CAAX结构的蛋白，在结直肠癌的发生发展中发挥至关重要的作用[22]。不断的有研究证明，结直肠腺瘤向结直肠癌的进展转变通常伴随RAS基因的持续激活[6]。且RAS突变的结直肠癌患者对抑制表皮生长因子的单克隆抗体治疗效果差，使得单药之傲的有效率从20%降至0%[23]。近年来随着对Ras蛋白的深入了解，发现RAS正确定位于细胞内膜这一过程是行使其生物学功能的关键，Rce1蛋白是这一过程中重要的酶[24]。首先，RAS蛋白的法尼基或香叶基脂半胱胺酸残基的硫醇开始异戊烯化。随后，蛋白质的最后三个氨基酸(即-AXX)被定位于内质网上的Rce1水解酶特异性内切蛋白酶切除。最后，异戊烯半胱氨酸新暴露的羧基端被戊烯半胱氨酸甲基转移酶(ICMT)甲基化因此。RAS蛋白经过这三步骤处理过程后才能激活下游信号传导通路[25]。这一发现为靶向药物的研究带了曙光，其中代表是法尼基转移酶抑制剂的研究，动物实验表明法尼基转移酶抑制剂有效抑制了Ras蛋白活性，但临床应用尚未得到证实[26]。Rce1也是一个潜在的治疗靶点，但目前对其研究和认识尚少，需要进一步深入研究。Rce1在结直肠癌中的作用机制尚未清楚，探讨Rce1在结直肠癌中的表达及其意义对临床诊疗具有一定意义。

本研究通过免疫组化的方法检测Rce1蛋白在结直肠癌组织及匹配癌旁正常组织中的表达情况。结果发现Rce1蛋白在癌组织中的表达明显低于癌旁组织。进一步的Kaplan-Meier生存分析及Cox分享回归显示低表达Rce1是结直肠癌预后不良的独立危险因素，因部分II期和III期结直肠癌患者易早期发生复发转移[6]，进一步的生存分析结果显示低表达Rce1的患者预后不良。Rce1协同TNM分期系统有利于结直肠癌患者的个体化治疗。为了探讨Rce1可能通过何种途径影响患者的生存预后，我们分析了Rce1表达情况与病人临床病理参数的关系。Rce1低表达与患者的肿瘤浸润深度、有无淋巴结转移相关，结果提示Rce1可能与肿瘤细胞的侵袭相关。但其中的分子机制需进一步研究[27-28]。综上所述，低表达Rce1是结直肠癌预后不良的指标，可更好协同TNM分期系统来协助临床诊疗工作。