雌二醇对前列腺上皮细胞增殖的影响及相关机制

杨宇峰 庄 炫 邢金春 (厦门大学附属第一医院泌尿外科，福建 厦门 361003)

前列腺增生(BPH)与男性的年龄及睾丸功能密切相关，研究发现60岁及以上有超过50%患有此病〔1，2〕。目前BPH的发病机制尚未明确，前列腺细胞数目增多及间质成分的增加是BPH的主要病理特征，因此细胞的增殖与凋亡成为BPH发病机制的热点研究方向之一。另外中老年人睾丸功能减弱，雄激素分泌较少，而雌激素分泌量增加，因此雌激素被认为是BPH发生的主要致病因素〔3〕，且BPH发病过程中一定浓度的雌激素能与雌激素受体结合，进而刺激前列腺上皮细胞增殖，导致BPH的发生〔4〕，但具体的作用机制未知，本研究拟探讨雌二醇对前列腺上皮细胞增殖的影响及机制。

1 材料与方法

1.1 试剂与仪器 雌二醇购自中国食品药品检定研究院;3-(4，5-二甲基噻唑-2)-2，5-二苯基四氮唑溴盐(MTT)、DMEM培养基、胎牛血清均购自美国Gibco公司;细胞周期检测试剂盒购自南京凯基生物技术有限公司;EdU细胞增殖检测试剂盒购自广州锐博生物技术有限公司;兔抗人B淋巴细胞瘤(Bcl)-2、Bal-2相关X蛋白(Bax)、细胞周期蛋白(Cyclin)D1、CyclinE、磷脂酰肌醇3激酶(PI3K)、蛋白激酶B(AKT)、p-AKT及甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH)多克隆抗体均购自美国Abcam公司。MK3酶标仪购自美国thermo公司;FACSCalibur流式细胞仪购自美国BD公司;TS100倒置荧光显微镜购自日本Nikon公司。

1.2 MTT法检测BPH-1前列腺上皮细胞活力 将6×103个BPH-1前列腺上皮细胞接种到96孔板，培养24 h后，0(对照组)、10－9、10－8、10－7、10－6、10－5mmol/L的雌二醇作用BPH-1细胞48 h，每孔加入终浓度为5 mg/ml的MTT并孵育4 h后，舍弃上清液，再加入150 μl二甲基亚砜，震荡使结晶物溶解，于酶标仪波长560 nm处测OD值。

1.3 EdU染色检测BPH-1前列腺上皮细胞增殖情况将6×103个BPH-1细胞接种到96孔板，培养24 h后，0、10－8、10－7、10－6mmol/L 雌二醇作用 BPH-1 细胞48 h，根据EdU试剂盒对细胞进行固定，染色，最后于荧光显微镜下观察并拍照。EdU染色呈现红光，Hoechst染色呈现蓝光。

1.4 流式细胞术检测BPH-1前列腺上皮细胞周期将 9×103个 BPH-1 细胞接种到 6 孔板，0、10－8、10－7、10－6mmol/L雌二醇作用BPH-1细胞48 h，每组收集1×105/ml个细胞，再加入Rnase并吹打混匀后，37℃孵育1 h，继续加入碘化丙啶(PI)染液，吹打混匀并于室温避光孵育30 min，1 h内在流式细胞仪进行细胞周期检测分析。

1.5 Western印迹检测BPH-1前列腺上皮细胞中PI3K/AKT信号通路相关蛋白的表达 将9×103个BPH-1 细胞接种到 6 孔板，0、10－8、10－7、10－6mmol/L雌二醇作用BPH-1细胞48 h，在4℃条件下刮下细胞并裂解30 min，离心收集上清液即是总蛋白。采用二喹啉甲酸(BCA)试剂盒测定蛋白浓度。制作浓缩胶及分离胶，并水封室温静置30 min。蛋白样品煮沸后上样，进行十二烷基苯磺酸钠凝胶电泳1～2 h。5%脱脂奶粉封闭 1 h，一抗溶液(兔抗人 Bax、Bcl-2、CyclinD1、CyclinE、PI3K、p-AKT、AKT 及 GAPDH 多克隆抗体，稀释度为1∶100)孵育，4℃过夜;二抗溶液室温孵育1～2 h。于凝胶成像系统中曝光。

1.6 统计学方法 应用SPSS17.0软件行t检验。

2 结果

2.1 雌二醇对BPH-1前列腺上皮细胞活力的影响与对照组(0.48±0.04)比较，10－8(0.55±0.05)、10－7(0.63±0.06)、10－6mmol/L 雌二醇(0.75±0.07)能显著提高细胞活力(P＜0.05)，而 10－9mmol/L雌二醇(0.49±0.04)对细胞活力无影响(P＞0.05)，10－5mmol/L雌二醇(0.42±0.04)显著降低细胞活力(P＜0.05)。

2.2 雌二醇对BPH-1前列腺上皮细胞增殖能力的影响 10－8、10－7、10－6mmol/L 雌二醇作用 BPH-1 细胞48 h 后，经 EdU 染色发现，与对照组比较，10－8、10－7、10－6mmol/L雌二醇能显著提高细胞增殖率(P＜0.05)。见图1，表1。

2.3 雌二醇对BPH-1前列腺上皮细胞周期的影响与对照组比较，10－8、10－7、10－6mmol/L 雌二醇缩短细胞的G1期，使细胞快速进入细胞分裂(P＜0.01)。见表1。

2.4 雌二醇对 BPH-1细胞中 Bax、Bcl-2、CyclinD1及CyclinE 含量的影响 与对照组比较，10－8、10－7、10－6mmol/L雌二醇能显著下调 Bax表达，显著上调Bcl-2、CyclinD1及 CyclinE 表达(P＜0.05)。见表 1，图2。

图1 雌二醇对BPH-1前列腺上皮细胞增殖能力的影响(×200)

表1 雌二醇对BPH-1细胞增殖及细胞周期、BPH-1细胞中Bax，Bcl-2，CyclinD1及CyclinE含量的影响(，%，n=6)

表1 雌二醇对BPH-1细胞增殖及细胞周期、BPH-1细胞中Bax，Bcl-2，CyclinD1及CyclinE含量的影响(，%，n=6)

与对照组比较:1)P＜0.01;下表同

组别 细胞周期增殖率 G1期 S期 G2期Bax/GAPDH Bcl-2/GAPDH CyclinD1/GAPDH CyclinE/GAPDH对照组 0 68.42±6.84 13.58±1.35 18.00±1.80 0.98±0.10 0.15±0.01 0.20±0.02 0.21±0.02 10－8mmol/L 组 18.34±1.821) 59.32±5.921) 16.47±1.651) 24.21±2.421) 0.49±0.051) 0.19±50.021) 0.33±0.031) 0.34±0.031)10－7mmol/L 组 27.21±2.721) 53.46±5.351) 19.48±1.951) 27.06±2.701) 0.25±0.021) 0.32±0.031) 0.65±0.061) 0.66±0.071)10－6mmol/L 组 38.42±3.841) 48.33±4.831) 22.35±2.231) 29.32±2.931) 0.18±0.021) 0.95±0.091) 0.99±0.101) 1.02±0.101)

图2 雌二醇对BPH-1细胞中Bax、Bcl-2、CyclinD1及CyclinE含量的影响

2.5 雌二醇对BPH-1细胞中PI3K/AKT信号通路相关蛋白表达的影响 与对照组比较，10－8、10－7、10－6mmol/L雌二醇能显著上调PI3K及p-AKT表达(P＜0.05)。见表 2，图 3。

表2 雌二醇对BPH-1细胞中PI3K/AKT信号通路相关蛋白表达的影响(，n=6)

表2 雌二醇对BPH-1细胞中PI3K/AKT信号通路相关蛋白表达的影响(，n=6)

组别 PI3K/GAPDH p-AKT/AKT对照组 0.13±0.01 0.10±0.01 10－8mmol/L 组 0.25±0.021) 0.20±0.021)10－7mmol/L 组 0.42±0.041) 0.38±0.031)10－6mmol/L 组 1.33±0.131) 1.06±0.101)

图3 雌二醇对BPH-1细胞中PI3K/AKT信号通路相关蛋白表达的影响

3 讨论

目前研究认为男性体内雄-雌激素失衡是BPH发生的重要原因，其中雌激素以具有活性的雌二醇形式存在，雌二醇在BPH过程中分泌量增加〔3〕。雌二醇能与存在于前列腺间质细胞中的受体结合，进而激活下游信号通路，刺激前列腺上皮细胞增殖，但具体的作用机制未知。本研究结果与雌二醇对成骨细胞及子宫内膜基质细胞增殖促进作用的剂量浓度范围一致〔5〕，也与以往学者报道一致〔4〕，说明一定浓度范围的雌二醇对BPH-1细胞增殖具有促进作用，超过一定浓度后对BPH-1细胞增殖具有抑制作用。

BPH与前列腺细胞过度增殖密切相关，此过程与细胞周期有关。细胞周期检查点的缺陷及重大转变都有可能使细胞的生长发生异常〔6〕，大部分成熟的前列腺细胞基本处于G1期即休眠期，当受到上游信号刺激后，G1期的中、后期发生重大转化，导致细胞进入S期，加快DNA的合成〔6〕。与G1期密切相关的细胞周期蛋白有CyclinD1与CyclinE。CyclinD1先在G1期表达，与细胞周期依赖性蛋白(CDK)4/CDK6结合形成复合物，促使Rb磷酸化及核转录因子E2F进入细胞核，推动与细胞增殖相关基因的转录。在CyclinD1降解后，CyclinE是G1期起主要促进作用的细胞周期蛋白，与CDK2结合形成复合物，促使G1期向S期转换，并延续DNA的复制。另外细胞的过度增殖来源于细胞凋亡的抑制，细胞凋亡受细胞凋亡基因调控，其中Bcl-2是最常见的细胞凋亡家族。Bcl-2能与促凋亡蛋白Bax形成异源二聚体，阻断凋亡信号传递，促进细胞存活及增殖。而Bax能自身形成二聚体，促进凋亡信号传递到Caspase家族，并放大凋亡信号，最终诱导细胞凋亡。本研究结果说明一定浓度范围内的雌二醇能够通过调控细胞周期、细胞凋亡相关蛋白表达进而促进BPH-1细胞的增殖。

细胞的增殖、凋亡与多种信号通路密切相关，PI3K/AKT信号通路是其中最为常见的一种。PI3K是由p110和p85亚单位组成的二聚体，能够将下游底物二磷酸磷脂酰肌醇(PIP2)的3'羟基磷酸化，使之成为PIP3，PIP3进而促使AKT蛋白结构发生改变，并转位到细胞膜，而活化后的AKT能够激活下游靶基因，如Bcl-2、CyclinD1及MMPs等，进而参与细胞的增殖、凋亡、细胞周期等生物学行为〔7〕。同时雌二醇能够通过PI3K/AKT信号通路调控多种细胞的生物学行为〔8〕。本研究结果表明 10－8、10－7、10－6mmol/L 雌二醇能显著提高BPH-1细胞活力，缩短G1期，下调Bax表达，上调 Bcl-2、CyclinD1及 CyclinE表达，与激活PI3K/AKT信号通路有关。