组织转谷氨酰胺酶2对乙型肝炎相关性肝细胞癌进展的影响

王玉萍 张 娟 (河南省中医院 河南中医药大学第二附属医院肿瘤科，河南 郑州 450002)

肝细胞癌(HCC)常见的致病因素包括多种病因所致的肝硬化、慢性乙型、丙型肝炎病毒的感染、酗酒、代谢紊乱等，其中在亚洲人群内慢性乙型肝炎病毒感染及其相关的肝硬化是最常见的HCC的致病因素〔1～3〕。尽管对乙型肝炎病毒(HBV)的致病机制的相关研究一直在进行中，但患者最终的生存预后至今仍无显著改善，具体表现为早期诊断较差及有效治疗干预措施缺乏等〔4〕。HCC目前临床上最常应用的血清标志物为甲胎蛋白(AFP)，但研究显示将近40%的HCC患者AFP无显著升高，并且部分AFP显著升高的患者仅存在肝硬化或HBV感染的活动期，因此寻求一种新型的标志物以提高早期检测HCC的准确性，有利于后期患者治疗的预后改善是十分有必要的。最新的研究尝试使用cDNA微阵列分析探索基因表达因素与肿瘤侵袭性之间的相关关系，其具有准确性高、针对性强等优势，同时有研究通过肝癌细胞蛋白定量分析显示组织转谷氨酰胺酶(TGM)2具有作为新型组织/血清早期检测HCC标志物的潜能〔5～7〕，因此本研究中我们使用微阵列分析及免疫组化染色对乙型肝炎相关性HCC的进展与TGM2表达的关系进行初步探讨，以对临床诊治及相关研究有所指导及借鉴意义。

1 资料与方法

1.1 患者资料 本研究共纳入120例乙型肝炎相关性HCC患者，根据TNM分期研究人群分为Ⅰ～Ⅳ期，每期病例数均为30例。通过标准肝脏穿刺方法获取组织标本，操作均经我院伦理委员会及患者本人知情同意。

1.2 细胞系 研究中选择使用人肝癌细胞株HepG2，由于其承载了完整的HBV基因组，并且能够生成所有的病毒相关蛋白、HBV DNA及Dane颗粒;自中科院细胞研究所获得BEL7402肝癌细胞系，细胞均培养于含有高葡萄糖改良Eagle氏培养基内(HyClone)，添加10%胎牛血清(Gibco)，37℃，5%CO2。

1.3 方法 取20例HCC组织进行微陈列分析基因表达谱。为了验证TGM2差异性表达的显著性，我们对组织标本使用TGM2抗体进行免疫组化染色，若TGM2免疫检测阳性的细胞超过50%，则定义为TGM2大量表达，初步假设TGM2抑制剂可能作为治疗的靶方向，使用5、10、15、20 nmol/L 胱胺作用于 HCC 48 h的肿瘤细胞，观察HCC的细胞存活率。

1.4 微阵列分析 使用RNA提取试剂盒自原代细胞培养物内提取RNA，并对其质量及完整性进行检验;使用Affymetrix公司的U133加2.0阵列表达谱进行分析。按照标准方法进行cDNA的合成、探针标记、杂交及阵列扫描，按照文献中报道的方法进行基本微阵列数据的可视化及数据过滤〔8〕。使用dCHIP程序进行组间的阵列数据分析比较，建立样本分组，使用中强度探针对变量进行标准化并作为阵列参数的基准水平，基于模型的表达通过完美匹配/不匹配差分模型进行计算分析。

1.5 免疫组化染色分析 组织标本或细胞使用4%多聚甲醛磷酸盐缓冲液(PBS)进行固定，之后进行石蜡包埋并按照标准方法步骤进行染色，简要言之首先使用二甲苯去除石蜡，后对标本进行不同浓度乙醇的脱水，然后使用2%山羊血清进行封闭。随后样本与一抗进行过夜孵育(4℃)，室温下二抗与辣根过氧化物酶(HRP)结合1 h，通过HRP底物实现信号强弱的可视化。一抗包括:多克隆兔抗GFAP(Chemicon International公司)、单克隆鼠抗 EMA(Thermo Scientific)、多克隆兔抗S100和单克隆小鼠抗波形蛋白(Dako公司);TGM2抗体购自Abcam公司;对肿瘤区域至少随机选择4个高强度区域(HPF)进行分析，研究者独立对HPF的细胞进行计数并记录为%/HPF。

1.6 Western印迹分析 收集肿瘤细胞后使用低温PBS洗涤2次，后使用RIPA缓冲液进行细胞裂解，获得的细胞裂解物首先于冰上静置 30 min，后13 000 r/min离心10 min后再次将沉淀悬浮于含有十二烷基硫酸钠(SDS)及33%甘油的缓冲液内，获得的蛋白质通过SDS-聚偏氟乙烯(PVDF)进行分离并转移至硝酸纤维素膜上(Bio-Rad公司)利用适宜的抗体、HRP结合的二抗及增强化学发光检测系统(GE，费尔菲尔德)进行Western印迹分析。最后通过GS-800校准密度仪(BioRad公司)对相对表达水平进行定量。

1.7 统计学方法采用SPSS20.0软件进行t检验。

2 结果

2.1 基因表达图谱 用于微阵列分析的总计20例组织样本，多变量分析聚类产生的热图显示存在2 552个转录的差异性表达;而后通过MATLAB版本(R2013a)使用“＇mafdr＇”指令来计算错误发现率(FDR)用于Ⅰ期与Ⅳ期HCC的多重比较检验假设，结果显示与Ⅰ期相比，Ⅳ期时TGM2的基因表达显著升高，差异有统计学意义(P＜0.05)。见图1。

图1 Ⅰ期与Ⅳ期HCC基因表达微阵列分析

2.2 HCC内TGM2的表达 TGM2的大量表达主要见于Ⅲ期(79.8%)及Ⅳ期(91.2%)HCC，显著高于Ⅰ(23.5%)～Ⅱ期(43.8%)肿瘤组织内的水平(P＜0.05)，提示TGM2的表达可能与肿瘤的侵袭性及病情进展相关。

2.3 抑制TGM2促进细胞死亡 在使用胱胺后48 h后，肿瘤细胞的存活率下降(5，10，15，20 nmol/L 胱胺组存活率分别为63.4%，51.3%，45.6%，36.5%)至最大值的36.5%左右。

3 讨论

HBV相关的慢性肝脏病变是HCC的最主要病因之一，据报道若无干预措施其发展成肝硬化的概率可达40%左右，极大地增加了罹患HCC的风险。此类患者的预后很大程度上与早期的诊断及后期的有效治疗措施密切相关〔9〕。

TGM2作为多功能酶能够对转录后的蛋白质进行修饰，形成谷氨酰胺和赖氨酸侧链分子间的异肽键，其参与不同的生物作用过程，有研究显示其在乳糜泻、神经变性疾患及部分癌症等中发挥重要作用〔10，11〕。最新的研究亦证实TGM2的表达水平上调与结直肠癌、非小细胞型肺癌、喉癌等癌症的预后差相关，并且有研究认为其可作为乳腺癌或肺癌化疗抵抗的有效标志物，对于脑部神经胶质瘤患者TGM2的表达上调显著减少患者的生存期〔12〕;而若使用胱胺、葡糖胺或KCC009对TGM2进行抑制则能够显著促进神经胶质瘤、乳腺癌或胰腺癌的细胞死亡，同时研究显示TGM2的表达上调与肿瘤的侵袭性较强相关，因此其可作为治疗部分类型癌症的作用靶点〔13～17〕。

TGM2在诸多组织内可大量表达，并且可存在于细胞的多个区域，包括细胞外基质、细胞膜、细胞质、线粒体及细胞核内，其在细胞生长、分化及凋亡中通过多种作用机制施加负面作用，具体包括转酰氨基酶、GTP酶、细胞黏附、蛋白质二硫键异构酶、激酶和蛋白质折叠等〔18〕。TGM2在肿瘤形成中的具体作用机制目前仍不清楚，但相应的存在几种机制。有学者认为TGM2可以激活核因子(NF)-κB、局部的黏连激酶(FAK)酪氨酸激酶，进而激活抗细胞凋亡通路，实现肿瘤细胞的永生化〔19〕。若使用 TGM2的抑制剂KCC009可使Akt磷酸化下降而促凋亡蛋白Bim的表达上调，从而使肿瘤组织细胞的细胞凋亡过程显著增强〔20，21〕。

综上所述，本研究结果初步证实在HBV相关的HCC组织中TGM2的表达水平与肿瘤的侵袭性及分期相关，通过竞争抑制TGM2的作用通路可促使肿瘤细胞凋亡。