Wnt信号通路在狼疮性肾炎发病过程中的作用

孙铁霖 李 里 宫 亮 (锦州医科大学，辽宁 锦州 00)

系统性红斑狼疮(SLE)是一种由于免疫系统功能紊乱，产生大量的自身抗体，进而对各个系统脏器产生破坏的自身免疫性疾病。在遗传因素、环境因素、雌激素水平等各种因素相互作用下，导致T淋巴细胞减少、T细胞功能降低、B细胞过度增生，产生大量的自身抗体，并与体内相应的自身抗原结合形成相应的免疫复合物，沉积在皮肤、关节、小血管、肾小球等部位。在补体的参与下，引起急慢性炎症及组织坏死(如狼疮性肾炎)，或抗体直接与组织细胞抗原作用，引起细胞破坏(如红细胞、淋巴细胞及血小板壁的特异性抗原与相应的自身抗体结合，分别引起溶血性贫血、淋巴细胞减少症和血小板减少症)，从而导致机体的多系统损害。其中累及肾脏引起的狼疮性肾炎最为常见，狼疮性肾炎的严重程度及治疗效果是评估预后的主要因素〔1〕。在狼疮肾炎的治疗中，仍然以激素及免疫抑制剂联合治疗为主。目前治疗狼疮性肾炎是否有其他的治疗手段仍是当前研究的热点。Wnt/β-catenin是重要的细胞信号转导通路，Wnt糖蛋白同Fz蛋白受体结合，在细胞表面聚集，进而激活β-catenin聚集，发挥作用〔2〕。以往研究表明该通路在胚胎形成发育过程及纤维化过程均发挥重要作用。目前最新观察发现，Wnt/β-catenin通路可能参与狼疮性肾炎的发病过程〔3〕。本研究探讨Wnt/β-catenin在狼疮性肾炎发病过程中的作用。

1 材料与方法

1.1 研究对象 2013～2015年锦州医科大学附属第一医院行肾活检的狼疮性肾炎患者42例，年龄51～67岁。入选患者均符合美国风湿病学会的SLE诊断标准，在11项标准中符合至少4项，且均有肾脏受累表现。收集患者临床资料SLE活动指标(SLEDAI)积分评估疾病活动度。患者均行肾活检，其中病理分型Ⅲ型4例，Ⅳ型13例和Ⅴ型25例。另取16例肾癌手术患者，男7例，女9例，年龄50～68岁，平均65.1岁。取肾癌旁的正常组织(距肿瘤组织2～5 cm)作为对照组。

1.2 应用Western印迹法检测肾脏活检标本中βcatenin蛋白的表达 收集细胞，磷酸盐缓冲液(PBS)漂洗，1 500 r/min离心5 min。加入适量三去污细胞裂解液，充分混匀，冰上超声波碎裂后，放置30 min;4℃，12 000 r/min离心20 min，吸取上清以考马斯亮蓝测定蛋白样品浓度。将蛋白质样品与凝胶加样缓冲液均匀混合，煮沸变性5 min，－80℃保存备用。用1 ml加样器将混合液加入玻璃板夹心的凝固的分离胶上面，直至夹层顶部。立即将0.75 mm的梳齿插入夹层顶部的浓缩胶中，室温静置30 min。待胶凝固后置于－4℃保存，第2天备用。电泳槽内加入电泳缓冲液后，用微量加样器低温条件下将制好的蛋白样品上样，每孔上样量为100 μg，80 V电压，直至溴酚蓝指示剂迁移至分离胶底部，关闭电源。经过SDS电泳后，经过硝酸纤维素膜转印，检测β-catenin蛋白表达。其中β-catenin单克隆抗体的稀释度为1∶2 000，辣根过氧化物酶标记的马抗羊抗体稀释度为 1∶1 000。用β-catenin的灰度值表示 β-catenin的相对表达水平。以β-actin为内参对照产物进行半定量分析。

1.3 实时定量PCR测定β-catenin mRNA在肾脏活检标本中的表达 将各组细胞中加入1 ml裂解液，充分混匀，在室温下放置5 min。加入200 μl氯仿，盖好管盖，涡旋振荡器充分振荡15 s，室温放置3 min。4℃12 000 r/min离心10 min，样品分成三层:黄色的有机相、中间层和无色的水相，RNA主要在水相中，水相的体积约为所用裂解液RZ试剂的50%。把水相转移到新管中，进行下一步操作。缓慢加入0.5倍体积无水乙醇，混匀(此时可能会出现沉淀)。将得到溶液和沉淀一起转入吸附柱3中，4℃ 12 000 r/min离心30 s，弃掉收集管中的废液。向吸附柱3中加入500 μl去蛋白液，4℃ 12 000 r/min离心30 s，弃废液。向吸附柱3中加入 500 μl漂洗液，室温静置 2 min，4℃12 000 r/min离心30 s，去除残余液体。将吸附柱放入1.5 ml收集管中，4℃ 12 000 r/min离心2 min，去除残余液体。将吸附柱CR3转入一个新的离心管中，加40 μl无 水 RNase ddH2O，室 温 放 置 2 min，4℃12 000 r/min离心2 min，所得到的即样本总RNA。置于－70℃冰箱保存。将RNA反转录成cDNA，具体方法参照逆转录cDNA试剂盒说明，提取10 μl cDNA，37℃ 15 min，85℃ 5 min，至40℃。mRNA 表达水平检测采用实时定量PCR技术，β-catenin引物:上游:5＇-GGCTTCTGATAAAGGGTACTGTTG-3＇，下游:5 ＇-ACGCAAAGGTGCATGATTTG-3＇，β-actin 作为内参照。

1.4 统计学处理 采用SPSS15.0统计学软件行单因素方差分析和LSD-t检验、χ2检验。

2 结果

2.1 狼疮性肾炎患者基本临床资料及实验室检查结果 狼疮性肾炎患者以年轻女性发病为主，病理分型以Ⅴ型多见，Ⅴ型SLEDAI积分明显较低，Ⅴ型的24 h尿蛋白及血清肌酐水平较Ⅳ型均明显降低(P＜0.05)，Ⅴ型补体C3较Ⅳ型明显升高(P＜0.05)，见表1。

表1 狼疮性肾炎患者临床及实验室检查结果()

表1 狼疮性肾炎患者临床及实验室检查结果()

与Ⅳ型相比:1)P＜0.05

组别 n 男/女(n) 年龄(岁)SLEDAI积分(分)24 h尿蛋白(g/d)血清肌酐(μmol/L)CRP(mg/L)补体C3(g/L)补体C4(g/L)IgG(g/L)IgA(g/L)Ⅲ型 4 0/4 61.7±10.2 8.98±3.9 4.38±3.2 61.6±17.7 5.0±4.3 0.59±0.31 0.11±0.11 12.3±18.0 1.94±1.0Ⅳ型 13 0/13 67.0±13.9 8.79±3.5 4.18±3.1 97.4±65.1 4.1±2.1 0.42±0.19 0.06±0.04 7.7±3.8 1.97±0.7Ⅴ型 25 3/22 64.2±11.8 6.98±3.41) 2.38±1.91) 53.1±17.31) 5.9±8.6 0.63±0.231) 0.11±0.07 11.0±6.2 2.53±1.1合计 42 3/39 65.1±10.1 7.98±3.6 2.98±2.9 67.4±42.7 5.1±6.5 0.55±0.24 0.09±0.07 10.3±5.5 2.27±1.0

2.2 β-catenin蛋白在肾脏活检标本中的表达 βcatenin蛋白在狼疮性肾炎患者肾组织标本中的表达(0.586±0.123)明显高于对照组(0.081±0.019)(P=0.003)。β-catenin蛋白在Ⅴ型狼疮性肾炎患者的表达(0.798±0.715)较Ⅳ型(0.503±0.823)及Ⅲ型(0.592±0.113)明显升高(P＜0.05);Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ型均明显高于对照组(P=0.020、0.039、0.003)。

2.3 实时定量PCR检测肾脏活检标本中β-catenin mRNA 狼疮性肾炎组肾脏 β-catenin mRNA表达(3.096±0.123)较对照组(2.031±0.211)明显升高(P=0.009)，其中Ⅴ型β-catenin mRNA表达(3.616±0.116)较Ⅳ型(2.698±0.168)及Ⅲ型(2.913±0.294)明显升高(P＜0.05);Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ型均明显高于对照组(P=0.031、0.011、0.007)。

3 讨论

狼疮性肾炎按病理分型有6种:Ⅰ型主要是轻微的病变，Ⅱ型是系膜性，Ⅲ型是局灶性，Ⅳ型是弥漫性，Ⅴ型是膜性，Ⅵ是肾脏病变严重，大部分硬化、纤维化;以上的分型会转化〔4〕。本实验收集的Ⅴ型肾炎肾损害较Ⅳ型肾炎轻，这与之前临床研究发现的Ⅳ型肾炎较其他类型肾炎表现更重的观点一致〔5〕。

Wnt信号通路包括经典和非经典通路，Wnt/βcatenin通路为经典通路。在该信号通路中β-catenin处于中心位置，当Wnt通路没有被激活时，β-catenin残基被糖原合成激酶(GSK)-3β磷酸化，β-catenin被降解，使得胞内β-catenin数量稳定。当Wnt通路被激活时，一些因素使得GSK-3β活性被抑制，GSK-3β无法使 β-catenin 磷酸化和降解〔6，7〕。当细胞内 β-catenin数量增加到一定程度，就会与信号通路T细胞因子(TCF)/淋巴细胞增强因子(LEF)结合，进而激活Snail、Twist等，使得某些特定基因出现表达增强和减弱。Wnt信号通路在胚胎时期肾脏发育发挥了重大的作用，主要参与肾单位及肾小管的发育，尤其在肾小管发育的最初阶段发挥重要作用。另外多项研究表明，Wnt信号通路参与了多囊肾病及肾囊肿的形成〔8，9〕。在肾细胞癌的研究中发现，β-catenin的活化受到抑制，表明Wnt/β-catenin在肾细胞癌发病中被激活。在肾间质纤维化的模型中同时也发现了β-catenin的高表达〔10〕。虽然Wnt/β-catenin通路在多种肾脏疾病中出现了异常表达，但在狼疮肾炎患者上的研究目前并无报道。Tveita等〔3〕的研究表明狼疮性肾炎的发病中可能存在Wnt通路参与。分析原因，在狼疮性肾炎的发病过程中某种因素激活了Wnt信号通路，进而使细胞外基质金属蛋白酶(MMP)表达增加，使得细胞外基质发生重建，在不断的修复与重建中，狼疮性肾炎形态学变化就出现了〔6，11〕。

Tveita 等〔12，13〕在狼疮鼠模型中发现，MMP-2 和MMP-9表达及活性升高，其中MMP-9的表达水平与狼疮鼠的双链(ds)-DNA水平呈负相关。

本研究推测在狼疮性肾炎的发病过程中，可能激活了Wnt通路，该通路进而参与了狼疮性肾炎的发病，Ⅴ型狼疮性肾炎的发病过程中该通路起着更大的作用。以上研究结果与 Tveita等〔12，13〕研究相似，其在狼疮鼠模型NZB/NZW中发现，β-catenin mRNA表达水平在蛋白尿期明显升高，认为Wnt/β-catenin通路可能对狼疮性肾炎起重要调节作用。