罗氏全自动电化学发光免疫分析系统检测大小鼠甲状腺激素水平的实验研究

王红，王冉冉，赵得发，单忠艳，滕卫平，滕晓春

甲状腺疾病是常见的内分泌疾病之一，其患病率高，发病机制复杂［1-2］。目前关于甲状腺疾病的基础研究越来越受到重视，检测血清甲状腺激素水平是评估机体甲状腺功能状态的常用方法，在基础研究中广泛应用。甲状腺激素水平的测定主要有两种方法：一是高效液相色谱串联质谱法，其结果最为可靠，是检测甲状腺激素的金标准，但是价格昂贵，很难在实际研究中推广；二是免疫法，包括放射免疫法、酶联免疫法、化学发光免疫分析法等。放射免疫法灵敏度高，但因其有放射性污染、试剂有效使用期短等缺点，正在逐渐被非同位素标记法代替。酶联免疫法测定啮齿类动物甲状腺激素水平技术不成熟，目前市售的针对大、小鼠甲状腺激素水平测定的酶联免疫试剂盒，由于其检测误差很大，不被学界认可。化学发光免疫分析法是人类甲状腺激素测定的主要方法，其具有速度快、重复性好等优点，但目前国际上并没有针对大、小鼠特异性的甲状腺激素水平测定的电化学发光试剂盒。本研究旨在探讨利用罗氏全自动化学发光免疫分析系统和人的甲状腺激素试剂盒检测大、小鼠血清甲状腺激素水平的稳定性、可靠性以及比较不同品系大、小鼠血清甲状腺激素水平的差异。

1 材料与方法

1.1 实验动物及血清制备 2016年11月—2017年3月，实验动物购买于北京维通利华实验动物技术有限公司。在温度20～25 ℃和湿度40%～45%条件下喂养，每个饲养笼喂养3～4只鼠，光-暗周期为12 h，正常动物颗粒饲料与蒸馏水喂养10 d后进行后续实验。本研究获得中国医科大学附属第一医院医学科学研究伦理委员会批准。

1.1.1 昆明小鼠和SD大鼠混合血清制备 选取7～8周龄昆明小鼠60只和SD大鼠30只，戊巴比妥钠（0.9%氯化钠溶液溶解浓度为3%，注射剂量1.5 ml/kg），腹腔注射麻醉，小鼠用EP管摘眼球取全血，大鼠用促凝管心尖负压取全血，室温静置2 h后，4 ℃冰箱过夜，次日3 800 r/min离心10 min（离心力1 051×g），分离血清。混合血清4 ℃存放，3 d内检测。批内差检测：SD大鼠和昆明小鼠混合血清分别进行10次重复测定，计算批内平均值、批内标准差和批内变异系数，批内变异系数=标准差/平均值×100%。日间差检测：在相同的实验条件下，SD大鼠和昆明小鼠混合血清每日相同时间段分别测定1次，连续测定6 d，计算批间平均值、批间标准差和批间变异系数，批间平均值即将每日测定的10个混合血清的样本取均值后，再将连续6 d的均值取均值，批间标准差和批间变异系数计算公式如下：批间标准差批间变异系数SD为标注差，CV为变异系数。

1.1.2 不同甲状腺激素水平的昆明小鼠和SD大鼠血清制备 选取7～8周龄昆明小鼠30只，随机分为实验性甲状腺激素增多组、实验性甲状腺激素减少组和甲状腺功能正常组，各10只。实验性甲状腺激素增多组腹腔注射左甲状腺素（100 μg/100 g），每日同一时间注射，连续注射1周［4］。实验性甲状腺激素减少组采用0.025%甲巯咪唑、1%高氯酸钾、0.3%蔗糖混合后，喂水2周［5-7］。甲状腺功能正常组正常饮水和饲料喂养。1周后制备血清，方法同上。

选取7～8周龄SD大鼠30只，随机分为实验性甲状腺激素增多组、实验性甲状腺激素减少组和甲状腺功能正常组，各10只。实验性甲状腺激素增多组腹腔注射左甲状腺素（20 μg/100 g），每日同一时间注射，连续注射1周［8］。实验性甲状腺激素减少组采用0.025%甲巯咪唑喂水2周［9］。甲状腺功能正常组正常饮水和饲料喂养。1周后制备血清，方法同上。

1.1.3 不同品系实验动物血清制备 选取10周龄远交系SD大鼠、近交系BN大鼠、远交系昆明小鼠、近交系C57BL/B6N小鼠各20只，正常饲料和饮水喂养1周后制备血清，方法同上。

1.2 实验仪器和试剂盒 仪器：罗氏Cobas e601型全自动电化学发光免疫分析系统。罗氏电化学发光法检测试剂盒：总三碘甲状腺原氨酸（TT3）检测范围1.2～3.1 nmol/L，总甲状腺素（TT4）检测范围 66～181 nmol/L，游离三碘甲状腺原氨酸（FT3）检测范围3.6～6.8 pmol/L，游离甲状腺素（FT4）检测范围12～22 pmol/L。

1.3 统计学方法 采用SPSS 21.0软件进行统计学分析，以单样本K-S检验计量资料的正态性，数据以（x ±s）表示，多组间比较采用单因素方差分析，多重比较采用LSD-t检验或Tamhane's T2检验。以P＜0.05为差异有统计学意义。

表1 昆明小鼠和SD大鼠混合血清的甲状腺功能指标的批内差检测结果（n=10）Table 1 Measurements of intra-assay differences in thyroid function indicators in mixed serum from Kunming mice and SD rats

表2 昆明小鼠和SD大鼠混合血清的甲状腺功能指标的批间差检测结果（n=6）Table 2 Measurements of inter-assay differences in thyroid function indicators in mixed serum from Kunming mice and SD rats

表3 不同甲状腺激素水平的昆明小鼠、SD大鼠甲状腺功能指标检测结果比较（x±s）Table 3 Comparison of thyroid function indicators among different thyroid hormone levels in Kunming mice and SD rats

2 结果

2.1 甲状腺功能指标测定结果的稳定性 昆明小鼠、SD大鼠血清甲状腺功能指标批内变异系数分别为0.697%～1.853%、0.946%～1.253%（见表1）；昆明小鼠、SD大鼠血清甲状腺功能指标批间变异系数分别为1.389%～2.670%、1.150%～2.834%（见表2）。

2.2 不同甲状腺激素水平组甲状腺功能指标检测结果各组昆明小鼠、SD大鼠TT3、TT4、FT3、FT4水平比较，差异均有统计学意义（P＜0.05）；其中实验性甲状腺激素增多组TT3、TT4、FT3、FT4水平高于甲状腺功能正常组，实验性甲状腺激素减少组TT3、TT4、FT3、FT4水平低于甲状腺功能正常组，差异有统计学意义（P＜0.05，见表3）。

2.3 不同品系实验动物甲状腺功能指标的测定 各品系实验动物血清甲状腺功能指标离散度均较大，多数变异系数＞10.000%（见表4），近交系实验动物血清甲状腺功能指标集中趋势优于远交系（见图1～4）。

表4 不同品系实验动物血清甲状腺功能指标检测结果Table 4 Measurements of serum thyroid function indicators in different strains of rats and mice

图1 不同品系实验动物血清TT3水平Figure 1 Level of serum TT3 in different strains of rats and mice

图2 不同品系实验动物血清TT4水平Figure 2 Level of serum TT4 in different strains of rats and mice

图4 不同品系实验动物血清FT4水平Figure 4 Level of serum FT4 in different strains of rats and mice

3 讨论

甲状腺激素的化学本质是氨基酸的衍生物，属于小分子物质，不具有种属特异性［10］。因此，理论上以抗原-抗体特异性结合为反应原理的免疫电化学发光法的人试剂盒是可以检测大、小鼠的甲状腺激素水平。促甲状腺激素（TSH）与甲状腺激素不同［11］，TSH是糖蛋白，属大分子物质［12］，不同种属的TSH糖蛋白的三级结构不同，具有种属特异性，其结果受到以抗原-抗体特异性结合为反应原理的免疫电化学发光法的影响很大，因此本实验未予探讨。

本研究探讨了应用罗氏全自动电化学发光免疫分析系统，以人的甲状腺激素试剂盒检测大、小鼠血清中甲状腺激素水平的可行性。结果显示：（1）罗氏全自动电化学发光免疫分析系统检测大、小鼠甲状腺功能指标的批内差和日间差的变异系数均＜5.000%，可见罗氏全自动电化学发光免疫分析系统检测大、小鼠甲状腺功能指标的稳定性好，检测结果的可信度高［13］。（2）本研究根据目前国际上经典的实验性甲状腺激素增多症和实验性甲状腺激素减少症的造模方法制备了不同甲状腺激素水平的大、小鼠血清，检测结果发现，无论大鼠或小鼠，实验性甲状腺激素增多组、实验性甲状腺激素减少组与甲状腺功能正常组比较，各甲状腺功能指标的差异均有统计学意义，提示罗氏全自动电化学发光免疫分析系统的试剂盒能够区分大、小鼠血清甲状腺激素水平的不同。（3）本研究针对目前基础研究中常用的近交系和远交系的大、小鼠血清甲状腺激素水平进行比较，结果发现无论是近交系或远交系，大、小鼠个体间的甲状腺功能指标检测结果的离散度均较大，多数甲状腺功能指标的变异系数＞10.000%。散点图可见近交系的个体间检测结果的集中趋势优于远交系，这可能与近交系和远交系种属的交配方法有关。近交系是连续全同胞兄妹或亲子间交配20代以上所培育成的动物群体，其群体基因高度纯合和稳定。远交系是引种于某亲本或同源亲本的动物，让其不以近亲交配，也不与群外动物杂交而繁衍的动物种群，其目的是使得整个群体尽量防止近亲交配而保持相应的遗传变异，既保持群体的一般性又保持动物的杂合性，其遗传组成比较接近于自然状态下的动物群体结构［14-15］。

图3 不同品系实验动物血清FT3水平Figure 3 Level of serum FT3 in different strains of rats and mice

综上所述，利用罗氏全自动电化学发光免疫分析系统和人的甲状腺激素试剂盒检测大、小鼠血清中的甲状腺激素水平的稳定性好，能够区分不同甲状腺激素水平的大、小鼠血清甲状腺功能指标的差异。虽然近交系大、小鼠的甲状腺功能指标的个体间差异小于远交系，但是两种品系甲状腺功能指标的测定值个体间差异仍然很大，因此在动物实验中要保证足够的样本量，避免由于样本量不足带来的实验误差。本研究不足之处是由于目前国际上没有大、小鼠的血清甲状腺激素的质控品，因此本研究未能评估罗氏全自动电化学发光免疫分析系统对大、小鼠甲状腺激素测定结果的准确性和精密度。

志谢：感谢中国医科大学动物部提供动物饲养场所，以及中国医科大学内分泌研究所对本实验设备的支持。

作者贡献：单忠艳、滕卫平、滕晓春进行文章的构思与设计及论文的修订；王红、王冉冉进行研究的实施与可行性分析、统计学处理，撰写论文；王红进行数据收集；王冉冉、赵得发进行数据整理；王红、王冉冉、滕晓春进行结果的分析与解释；滕晓春负责文章的质量控制及审校，对文章整体负责，监督管理。

本文无利益冲突。