我国优质蜂王浆评价指标的探索与建议

胡菡 李建科│文

中国农业科学院蜜蜂研究所，北京100093

前言

蜂王浆是蜜蜂哺育蜂咽下腺和上颚腺的分泌物，用来哺育蜂王和1～3日龄蜜蜂幼虫的白色或淡黄色乳状液体[1-5]。蜂王浆是天然功能性蜂产品，具有抑菌、抗氧化、抗衰老、降血糖、降血脂、抗肿瘤、调节免疫及护肤美容等多方面生理作用[6-14]。中国是世界蜂王浆第一生产国，年产约4000吨，也是第一出口国，世界上90%以上的蜂王浆来自于中国[15-17]。

蜂王浆成分复杂，营养丰富，水分含量为60.0%～70.0%，蛋白质含量为12.0%～15.0%，脂类物质为3.0%～6.0%，碳水化合物为10.0%～16.0%，小分子物质（如维生素、矿物质、游离氨基酸）为2%～3%[1,15，18-23]。蛋白质是蜂王浆中含量最丰富的有机成分，约占干物质的30%～50%[15；24-26]。而王浆主蛋白家族（Major Royal Jelly Proteins，MRJPs）占蜂王浆可溶性蛋白质含量的80%以上[22,27]。其中，MRJP1、MRJP2、MRJP3、MRJP4和MRJP5约占MRJPs总量的82%～90%[28]，它们是、蜂王浆生物学功能的主要体现者，因此，随着对蜂王浆成分和功能认识的不断深入，对MRJPs研究正在不断深化。

蜂王浆的品质与新鲜度之间存在密切的关系。在蜜蜂进化过程中，为了给蜂王提供最高效的食物，哺育蜂是以交喙的方式分泌蜂王浆饲喂给蜂王。哺育蜂也只是在幼虫需要进食时才分泌蜂王浆饲喂它们。哺育蜂一天会访问一个幼虫大约1,300次，在整个幼虫的发育期的访问次数会超过10,000次，特别是封盖前一天访问近3,000次[29]。这种进化方式最大程度的保证了蜂王浆的新鲜度，从而提供最高效的营养。然而蜜蜂的进化特征造就了蜂王浆是一种极其不稳定的天然产物，对储藏条件要求较高，各种因素包括温度、时间、空气、水蒸气和光都会对其产生影响[30]。日本研究表明，在室温下储藏1周，蜂王浆中蛋白质就有明显降解，储藏1个月会就发生质变[30]。随储藏时间的增长，蜂王浆颜色加深，黏度增大，产生气泡；水溶性蛋白和单糖含量降低，可滴定酸增加，维生素C含量降低，SOD酶活力下降，抑菌性下降[31-33]。因此，蜂王浆的储藏和保鲜一般在隔氧避光条件下进行低温冷冻包藏。若储藏不当，其各种性状（物理或化学）及其品质就会发生显著变化，蜂王浆的各种活性成分损失，其保健功能就会大幅降低，甚至丧失[34]。

我国蜂业生产的现实是蜂农转地放蜂，餐风露宿，生活条件十分艰苦。野外生活根本不可能有冰柜把生产的蜂王浆及时冷冻。很多收购商一周时间到蜂王浆生产集中的蜂农那里收购一次。零散的放蜂户生产的蜂王浆可能室温保存时间获更长。因此蜂王浆的新鲜度受到极大挑战。我国是蜂王浆生产和出口大国，世界各国对蜂王浆的品质要求日趋严格，但现行的质量评价标准仍具有局限性和单一性，因而，有必要探求和确定能真实、准确反映蜂王浆在条件变化下的品质指标，并建立快速、高效的蜂王浆品质变化鉴别方法是行业发展的需求。

优质蜂王浆10-羟基-2-癸烯酸（10-HDA）指标应适当提高

蜂王浆是天然的功能性保健品，其保健功能在于其含有的多种生物活性物质。又因为蜂王浆自身具有抑菌功能，只要包藏得到，取浆后无需任何后期加工，其所含生物活性物质也能够长期保存。因此，对蜂王浆品质的全面评价需要兼顾真伪和新鲜度两方面。

10-HDA是一种特殊的不饱和脂肪酸，又称王浆酸，在自然界中，仅蜂王浆中存在此种特殊的生物活性物质[35]。又因10-HDA在蜂王浆中含量稳定，国际公认其为蜂王浆的质量标准。我国现行国标《中华人民共和国国家标准 蜂王浆》（GB 9697-2008）将蜂王浆分为优等品和合格品两个等级，规定其中10-HDA含量分别为≥1.8%和≥1.4%。2016年9月，国际标准化组织（International Organization for Standardization，ISO）正式颁布的由中国、日本、法国、意大利、德国、土耳其、美国、泰国、马来西亚、印度、阿根廷、巴巴多斯等国家共同参与制定的蜂王浆国际标准（ISO 12824 : 2016）中也对10-HDA进行规定，要求不得低于1.4%。而外销出口蜂王浆中10-HDA含量一般要求在2.0%以上。10-HDA的经典和标准检测方法为高效液相色谱法，此方法准确、易操作。

但大量研究证实10-HDA非常稳定，即使在高温下也不会大量分解[30,36]。我们前期的研究发现，室温存放24周，蜂王浆中10-HDA的含量没有显著变化。因而，10-HDA并不适合作为蜂王浆新鲜度的评价指标，但作为蜂王浆真假的判断标准，其含量能在一定程度上反应蜂王浆的质量[21,37]。

蜂王浆中10-HDA含量受地理位置和花期影响而有所不同。研究发现云南省2009 年野藿香和2010年石榴、鬼针草3种植物生产的6种蜂王浆样品中，10- HDA含量均在1.8%～2.1%[38]。湖北、安徽等地蜂群生产的15个新鲜油菜蜂王浆样品中10- HDA含量范围为1.7%～1.9%[39]。来自我国19个省138个蜂王浆样品的10-HDA含量，发现我国西部地区10-HDA含量（2.01±0.05 %）显著高于东部地区(1.75±0.03%)和东北部地区(1.87±0.05%)；而不同花期10-HAD含量也不同，油菜、椴树和荆条花期蜂王浆中10-HDA含量分别为1.92%、1.80%和1.68%[40]。我们于2015年、2016年、2017年6～8月连续3年在北京地区进行蜂王浆生产试验，分别为2.16±0.14%，2.08±0.06%，2.21±0.04%（图1），3年间的测定结果差异不显著[41]，均高于1.8%。由此可见，蜂王浆中10-HDA含量受地理位置和花期影响而有所不同。综合我国生产实际，优质蜂王浆的中10-HDA 含量应高于1.8%。

2015年，2016年和2017年的6至8月连续3年在北京地区进行蜂王浆生产试验，测定其中10-HDA含量。每年获取20箱蜂3轮的生产数据。

图1 不同年份生产蜂王浆中10-HDA含量

蜂王浆主蛋白含量变化可真实反应蜂王浆新鲜度，应纳入优质蜂王浆质量指标

蜂王浆具有重要的生物学功能与其含有的MRJPs密切相关[26,42]，在蜜蜂生物学方面，MRJPs 参与决定蜂群中雌性蜂的级型分化[43,44]，为幼虫发育提供必要的可利用氮元素以及可能在蜜蜂行为调控中起作用等[45-47]。另外，MRJPs 对其他动物机体具有作用，主要表现为高效的抗菌活性，较强的免疫活性和促进特殊细胞增殖等[48]。例如，MRJP2具显著的有抗菌活性[49]；MRJP3在体内外均有免疫调节作用[50]。MRJP功能证据少，发给你的文章里有很多 因而，MRJPs在蜂王浆中的含量直接影响蜂王浆的功能，是蜂王浆品质的标志。

蜂王浆主蛋白作为评价蜂王浆新鲜度的标准并非我们第一次提出。日本科学家Kamakura 等人在2001年提出，随着温度升高和储存时间的延长，蜂王浆中MRJPs的含量也显著降低，其中一种57kD的蛋白可作为评价蜂王浆新鲜度的指标[30]，实际上这种蛋白是MRJP1，也有人建立了ELISA法，通过准确定量MRJP1浓度来评价蜂王浆新鲜度[51]，但含量在蜂王浆最高，做新鲜度指标不合适，并且一直未能在产业上应用。采用检测灵敏度较高的双相电泳和飞行时间质谱联用的方法发现，在4℃和-20℃的存放条件下，储存1年后，MRJPs含量显著降低，特别是MRJP3、MRJP4和MRJP5；特别是室温存放一年后，MRJPs已经降解严重，MRJP3-5已经检测不到；建议采用MRJP5作为评价蜂王浆新鲜度的标准[52,53]。

最近我们通过高分辨质谱和生化检测验证对蜂王浆中的所有蛋白质进行了一个随贮存温度和时间的监测，发现蜂王浆中可溶性蛋白质随贮存温度的升高和时间的加长都有很大程度的降解；MRJP1-5的含量最高，且含量稳定，占总可溶性蛋白的80%以上，易于检测；其中，MRJP1和MRJP2含量最高，但表现对温度不敏感，在室温和4℃存放4周降解不明显，甚至在37℃能够稳定存在1周。MRJP3-5对温度非常敏感，在室温和4℃存放随时间延长而逐渐降解，在室温存放2周开始，3种蛋白含量开始显著降低；MRJP4在这3中蛋白中含量最低，对高温也更加敏感，在37 ℃条件下存放3天，MRJP4就已经完全降解而检测不到（图2）。因此，MRJP3和MRJP4作为蜂王浆质量（新鲜度）检测的标记物最佳。

图2 不同温度存放不同时间后MRJP1，MRJP2，MRJP3和MRJP4含量Western-Blotting检测

根据上述原理，为了准确对这几种蜂王浆主蛋白进行准确定量，我们针对MRJP1-5制作了单抗，能够明确区分这5种同源性较高的蛋白质。利用MRJP3和MRJP4的单抗，我们已经研发制作成了双夹心ELISA试剂盒，分别对这两种蛋白进行准确定量。双夹心ELISA需要获得针对受检蛋白的一对异性抗体，先将一种特异性抗体结合到固相载体上形成固相抗体，然后和待检样品中的相应抗原结合形成免疫复合物，洗涤后再加酶标记的另一特异性抗体与免疫复合物中抗原结合形成酶标抗体-抗原-固相抗体复合物，加底物显色，判断抗原含量。由于采用了特异性抗体对，大大减少了假阳性反应。在进行同源性较高蛋白家族中某一种蛋白的定量时更加准确。双夹心ELISA试剂盒体系稳定、准确性高，在实际检测中应用非常广泛[54-56]，也被应用于国家和地方检测标准。因而，通过对这两款试剂盒平行性和稳定性的多次检测，确定这两款试剂盒能够做到对MRJP3和MRJP4的准确定量从而评定蜂王浆的新鲜度。

结论

基于上述研究进展与分析测试，我们认为优质蜂王浆的10-HAD含量至少应为1.8%；同时MRJP3和MRJP4应增加为优质蜂王浆新鲜度的判定指标，其含量应分别大于或等于0.8g/100g和0.2g/100g。由于理论研究和技术创新问题，蜂王浆新鲜度在现行的国标和国际标准都未曾涉及，但基于目前技术发展状况，将MRJP3和MRJP4作为新鲜度指标时机基本成熟。将此新鲜度指标作为优质蜂王浆指标具有一定的创新，对引领产业发展具有重要意义。

蜂王浆对我国蜂产业发展至关重要，也是最具市场竞争力、最具高附加值的蜂产品。作为世界蜂王浆生产和出口第一大国，我们不仅只是生产大国，而且要通过科技创新，形成支撑产业发展的理论，通过技术创新和产品创造，实现引领消费，最终实现产业转型。通过对近年来国内蜂王浆成分、功能研究以及蜂王浆标准的研读，我们在现有蜂王浆质量标准的基础上，尝试性提出了我国优质蜂王浆的标准，这对我国蜂产业发展具有重要意义。