不同剂量异鼠李素对炎症损伤小鼠巨噬细胞RAW264.7增殖能力的影响及其机制探讨

王科，庞辉，梁春梅，罗创才，黄海珠，周玉权，吴青燕，韦娇

(1广西医科大学基础医学院，南宁 530021；2西安长安医院)

炎症反应是机体对于刺激的一种免疫性防御反应，通常情况下是有益的，是人体的自动的防御反应，但是如果炎症过激，也会对机体的组织产生损伤作用。在免疫系统中，巨噬细胞是人体的第一道防线，其几乎参与人体所有的免疫应答过程，对于识别、产生免疫应答及清除侵入人体的细菌、病毒或异物，以及人体产生的衰老、损伤细胞和坏死组织等起重要作用[1]。异鼠李素(ISO)是一种拥有多种药理作用的植物类黄酮化合物，结构为3，5，7，4′-OH3′-CH3，广泛存在于银杏、沙棘等多种植物的花、果实和叶中，有抗心律失常、心肌缺血、缺氧、清除氧自由基，抗病毒、抗肿瘤及减少血清胆固醇水平等作用[1～5]。最近研究[4～8]报道，ISO可显著抑制脂多糖诱导的急性肺损伤模型的中性粒细胞浸润，并减轻水肿。但目前针对ISO抗炎作用的文献报道较少。本研究观察了ISO对炎症损伤小鼠巨噬细胞RAW264.7增殖能力的影响，并探讨其机制。

1 材料与方法

1.1 药物、细胞、试剂及仪器 ISO(中国科学院成都生物研究所，批号：MUST-16120110)。RAW264.7细胞(广西医科大学药学院)。1640培养基、小牛血清、0.25%的胰酶-0.02%EDTA消化液(美国Gibco公司)，双抗(美国Sigma公司)，脂多糖(LPS)、MTT(噻唑蓝)试剂盒(北京Solarbio公司)，一氧化氮(NO)试剂盒(北京百奥莱博科技有限公司)，TNF-α-ELISA试剂盒(南京建成生物工程研究所)。酶标分析仪(Thermo Labsystems公司)，倒置显微镜(日本奥林巴斯公司)，Integral 10纯水仪(美国Millipore公司)，二氧化碳恒温培养箱(美国Thermo Forma公司)，超净工作台(苏州安泰空气技术有限公司)。

1.2 RAW 264.7细胞培养、分组及ISO给予方法 用1640培养基(含10%FBS)在37 ℃、5%CO2培养箱中培养RAW 264.7细胞。待细胞生长数量至对数生长期时，37 ℃环境下用胰酶进行消化5 min，用1640完全培养基洗涤，800 r/min离心5 min。细胞计数后接种于96孔板，每孔105个细胞，每组设6个复孔，总共铺4块板，贴壁培养12 h后按不同实验目的处理。所有细胞分为5组，对照组用溶剂DMSO(≤0.2%)代替药物培养细胞，模型组：用终浓度为10 ng/mL的LPS刺激细胞，使其产生炎症反应；低、中、高剂量组用10 ng/mL的LPS与终浓度为50、100、200 μg/mL的ISO(DMSO溶解)共同刺激细胞。

1.3 RAW264.7细胞增殖指数测算 细胞培养及分组参照“1.2”方法，分别在细胞培养12、24、36、48 h将MTT试剂加入到每个孔里，每孔50 μL，培养4 h后，弃去孔内培养基，每孔加入150 μL的二甲基亚砜，低速振荡5 min，在570 nm波长下，用酶标仪检测每个孔的OD值。计算细胞增殖指数，细胞增殖指数=药物组处理OD570 nm/对照组OD570 nm。

1.4 RAW264.7细胞NO检测 细胞培养及分组参照“1.2”方法，在细胞培养24 h后，每孔吸取上清100 μL，按照NO试剂盒说明书处理。在450 nm波长下，用酶标仪检测每个孔的OD值，根据标准曲线计算NO分泌量。

1.5 RAW264.7细胞TNF-α检测 细胞培养及分组参照“1.2”方法，在培养细胞24 h后，取上清，按照ELISA试剂盒说明书处理。在450 nm波长下，用酶标仪检测每个孔的OD值，根据标准曲线计算TNF-α分泌量。

2 结果

2.1 12、24、36、48 h各组细胞增殖指数比较 结果见表1。

表1 12、24、36、48 h各组细胞增殖指数比较

注：与对照组比较，*P<0.05；与模型组比较，#P<0.05；与低剂量组比较，△P<0.05。

2.2 各组细胞NO、TNF-α水平比较 结果见表2。

表2 各组细胞NO、TNF-α水平比较

注：与对照组比较，*P<0.05；与模型组比较，#P<0.05；与低剂量组比较，△P<0.05。

3 讨论

炎症反应是一种防御性或自身调节性反应，它会造成患者自身组织损伤和功能紊乱。RAW264.7细胞为小鼠腹腔的一种巨噬细胞，是动物体内重要的免疫调节细胞和炎症反应中的效应细胞，它在不同的微环境下分泌出多种不同的炎症细胞因子，在炎症反应、组织修复及维持机体稳态等方面发挥了重要作用。内毒素是革兰氏阴性菌细胞壁的主要成分，其主要成分为脂多糖，可以诱导巨噬细胞分化，使其产生炎症细胞因子，在抵抗病原入侵的同时也引起炎症反应及组织异常损伤。

ISO属于黄酮类化合物，广泛存在于植物界中，具有较好的抗肿瘤、降血脂、降血压、抗氧化以及扩张冠脉等作用，在心血管系统疾病防治中具有广泛的应用前景[1～10]。近年对ISO的研究主要集中在抗肿瘤方面，而在抗炎方面研究报告很少。本研究显示，与对照组比较，模型组细胞12、24、36、48 h细胞增殖指数增加；与模型组比较，低剂量组24、36 h及中剂量组和高剂量组12、24、36、48 h细胞增殖指数减少；与低剂量组比较，中剂量组24 h及高剂量组24、48 h细胞增殖指数减少。上述结果提示ISO可抑制炎症损伤RAW264.7细胞增殖能力，且呈剂量依赖性，高剂量作用最大。

细胞因子是具有调节炎症反应、调节免疫的小分子反应蛋白。在巨噬细胞被激活后，细胞因子可以分泌如IL-6、IFN-α、IL-1β等促炎症细胞因子来调控免疫系统[10～15]。NO是一种细胞信号调节因子，可作为第二信使参与机体多个生理和病理疾病的过程[16]。有研究[17～19]表明，巨噬细胞可以释放NO参与抗肿瘤、抗病毒、炎症反应及免疫应答等病理过程。NO的合成依赖于iNOS(诱导型一氧化氮合酶)的表达，iNOS的产生也受到一些促炎症细胞因子(如TNF-α、IL-1β等)的调控[12～22]。于是我们推测，ISO抑制RAW 264.7细胞中NO的释放，可能是通过抑制细胞内iNOS的表达有关。巨噬细胞感染病菌时，释放出的TNF-α是一种重要的促炎症因子，能促使细胞的活化和增殖，引起局部或全身的炎症反应，并经常参与自身免疫性反应的疾病。因此，抑制TNF-α等炎症细胞因子的分泌，可能阻碍机体炎症病理的继续发展[23,24]。本研究显示，与对照组比较，模型组NO、TNF-α水平升高；与模型组比较，低剂量组NO水平及中剂量组和高剂量组NO、TNF-α水平降低；与低剂量组比较，中剂量组和高剂量组NO、TNF-α水平降低。上述结果提示，ISO可抑制炎症损伤RAW 264.7细胞增殖能力的机制可能与抑制NO、TNF-α水平有关。

总之，ISO能抑制RAN 264.7细胞的增殖，进而抑制NO及TNF-α的分泌，从而发挥抗菌消炎作用，这可能与ISO可以抑制iNOS的表达及NF-κB信号通路的激活有关。但是这种抗菌消炎作用可能还通过其他通路发挥作用，因而要明确ISO具体的抗炎机制，还需进行进一步的药理研究。