动态对比增强磁共振成像在脑胶质瘤患者瘤细胞增殖定量评估中的应用

贾中正，蒋佳珅，沈丹丹，花烨，葛敏，周学军

(南通大学附属医院，江苏南通 226001)

细胞增殖是脑胶质瘤的基本特征之一,评估细胞增殖已经成为预测胶质瘤预后的重要因素[1]。随着分子生物学的发展，分子标记物逐渐应用于胶质瘤细胞增殖的研究。Ki-67抗原是存在于增殖细胞核中的一种核蛋白，与细胞增殖密切相关；而且胶质瘤的Ki-67增殖指数已经被证明有助于胶质瘤的分级诊断与预后评价[2,3]。然而，Ki-67增殖指数需要在手术或穿刺取得肿瘤标本后进行免疫组化测算，这不仅会造成一定的损伤，而且还可能存在抽样误差。动态对比增强磁共振成像(DCE-MRI)作为一种无创的功能MRI技术，可以在术前对脑胶质瘤患者进行检查，而且已被证实可以用于评估胶质瘤分级与预后[4,5]。由于DCE-MRI、Ki-67增殖指数均有助于评估胶质瘤分级与预后，所以我们分析DCE-MRI有可能无创地评估胶质瘤Ki-67增殖指数，目前相关研究鲜有报道。本研究的目的是通过对胶质瘤DCE-MRI参数与Ki-67增殖指数进行对照分析，探讨DCE-MRI定量评估脑胶质瘤细胞增殖程度的价值。

1 资料与方法

1.1 临床资料 选取2015年1月～2017年12月南通大学附属医院收治的脑胶质瘤患者79例，男48例，女31例；年龄14～70岁，中位年龄45岁；根据2007版世界卫生组织(WHO)胶质瘤分级标准[6]，其中Ⅱ级30例[低级别胶质瘤(LGG)]和Ⅲ级8例、Ⅳ级41例[高级别胶质瘤(HGG)]。所有患者术前均未接受任何治疗，且均经手术病理证实。本研究经医学伦理委员会批准，所有患者均签字同意。

1.2 DCE-MRI指标检测方法 对每名患者在术前进行常规MRI和DCE-MRI检查。成像应用3.0T MR扫描仪(GE Healthcare，Milwaukee，Wisconsin)，线圈使用16通道相控阵头颅线圈。常规MRI扫描包括横断面快速自旋回波(FSE)T2WI(TR/TE 3 900 ms/118 ms)、自旋回波(SE)T1WI(TR/TE 1 700 ms/24 ms)、液体衰减恢复序列(FLAIR)(TR/TE 8 000 ms/170 ms)，FOV 240 mm×240 mm，矩阵256×256。扫描范围从颅底到颅顶，层厚6 mm，间隔2 mm。横断面常规MRI增强扫描在DCE-MRI扫描结束后进行。常规MRI的主要目的是用于初步诊断胶质瘤以及临床手术需要。DCE-MRI扫描：首先，横断面扫描5组T1-fast field echo(T1-FFE；RF-spoiled gradient echo)多翻转角序列，翻转角：3、6、9、12、15，扫描参数：TR 4.3 ms；TE 1.4 ms；层厚 2.8 mm，层间距1.4 mm；矩阵256×210；FOV 250 mm 250 mm。其次，在多翻转角序列第5次采集结束后进行DCE序列扫描，经肘静脉注入对比剂(Gd-DTPA-BMA，Ommiscan，GE Healthcare，Oslo，Norway)，速率为4 mL/s，总量为0.1 mmol/kg[7]，在对比剂注入结束后以相同速率注入生理盐水10 mL冲洗，扫描翻转角12 ，其余参数同多翻转角扫描序列。单次扫描时间7 s，共60期，DCE扫描总时间7 min。将多翻转角序列及DCE序列所有数据传入后处理软件模块(OmniKinetics，GE Healthcare，China)，选择上矢状窦作为标记血管。在该软件中选择改良的Tofts-Kermode模型，通过运算获得容积转运常数(Ktrans)、血管外细胞外间隙容积比(Ve)[8]。两位经验丰富的神经放射医师在Ktrans与Ve图的肿瘤最高信号区域手动设置感兴趣区(ROI)，ROI大小为20～40 mm2，每例胶质瘤测量3次，选取最大的Ktrans与Ve。ROI设置时应避免出血、坏死与正常脑血管。

1.3 Ki-67增殖指数测算方法 免疫组化采用Dako EnVision法，一抗采用Ki-67(鼠单克隆抗体，1∶100，Abcam)。所有的胶质瘤标本均通过临床手术获取。每例标本先通过4%甲醛固定，然后石蜡包埋，切取4 μm厚切片。切片后经过脱蜡、水化、抗原修复，然后进行染色。染色之后，先于低倍镜(40×)下找出Ki-67抗原标记密度“热区”，棕褐色为Ki-67抗原染色阳性。在高倍镜下采用CCD随机抽取5个视野的照片，采用Motic图像分析系统(version3.2,Motic China GroupCO. Ltd.)计算阳性着色面积占图像总面积的百分比，增殖指数计数=Ki-67阳性细胞/细胞总数×100%，选取最大值。

2 结果

2.1 不同级别胶质瘤Ktrans、Ve、Ki-67增殖指数比较 结果见表1。

表1 不同级别胶质瘤Ktrans、Ve、Ki-67增殖指数比较

注：与HGG比较，*P<0.05。

2.2 不同级别胶质瘤Ktrans、Ve与Ki-67增殖指数的相关性 结果见图1，由图1可知，HGG的Ktrans、Ve与Ki-67增殖指数均呈正相关(r分别为0.614、0.644，P均<0.05)，LGG的Ktrans、Ve与Ki-67增殖指数均无相关性(P均>0.05)。

3 讨论

胶质瘤是成人最常见的原发脑内肿瘤，致残率、致死率、复发率均比较高，严重影响患者生命与生活质量。根据WHO脑肿瘤分级标准，胶质瘤分为低级别(Ⅰ级、Ⅱ级)与高级别(Ⅲ级、Ⅳ级)，级别越高，恶性度越高。胶质母细胞瘤是最常见的胶质瘤，其肿瘤细胞增殖明显，且具有高度侵袭性、恶性程度最高的特点[9,10]。尽管治疗方法在不断取得进步，但目前胶质瘤的总体预后仍较差[11]。

注：图A、B显示HGG的Ktrans、Ve与Ki-67增殖指数呈正相关，图C、D显示LGG的Ktrans、Ve与Ki-67增殖指数均无相关性。

图1不同级别胶质瘤Ktrans、Ve与Ki-67增殖指数的相关性分析

胶质瘤细胞增殖是其生物学行为的主要特征，细胞增殖指数是定量评估胶质瘤生长及预后的重要标记物[12]。Ki-67增殖指数已被认为与胶质瘤细胞增殖密切相关，并且与胶质瘤的鉴别诊断与预后明显相关[13～16]。本研究显示，HGG的Ki-67增殖指数大于LGG，说明HGG具有更明显的肿瘤细胞增殖程度，与前期研究[17]结果一致。但是测量胶质瘤Ki-67增殖指数需要手术或定向穿刺获取肿瘤标本，然后再进行免疫组织化学检测，这不但有可能受到肿瘤发生部位或患者身体一般状况的限制，而且也有可能由于切除不全或肿瘤异质性而造成抽样误差。因此，无创性的细胞增殖检测技术对于诊断和治疗胶质瘤变得尤为重要。

MRI技术作为一种无创的检测手段，已经广泛应用于胶质瘤的诊断与鉴别诊断。DCE-MRI作为近些年新出现的功能MRI技术，已经用于胶质瘤的研究。DCE-MRI主要成像原理是利用顺磁性对比剂注入血管导致T1时间缩短的特性[18～20]，然后应用动态连续成像记录对比剂随时间在组织中的分布情况。DCE-MRI的两个主要参数Ktrans与Ve主要反映对比剂分子通过血管壁的能力，即血管的通透性，借此评估肿瘤血管的破坏程度，从而间接评价肿瘤的恶性程度。到目前为止，有关DCE-MRI的胶质瘤研究绝大多数都集中于微血管生成与通透性或灌注[7,21～24]，而DCE-MRI有关胶质瘤细胞增殖的研究很少。本研究显示，HGG的Ktrans、Ve均大于LGG，提示胶质瘤随着恶性程度的增高，肿瘤细胞增殖更加明显，同时伴随着肿瘤微血管的通透性增加，分析原因可能是因为在HGG中肿瘤细胞增殖明显，而现有的微血管不能满足肿瘤生长需要[25]。因此，HGG需要额外新生成血管提供更多的营养支持与合适的微环境来满足肿瘤细胞增殖。这些新生成的微血管分泌血管内皮生长因子(VEGF)，而VEGF可以进一步促使新血管生成而增加微血管渗漏[26]。由于胶质瘤持续生长需要大量消耗氧，所以肿瘤逐渐出现缺氧，而缺氧又可以通过调节VEGF促进新血管生成[27]。因此细胞增殖与新血管生成在胶质瘤生长过程中交替出现。胶质瘤新生成的微血管通常是不成熟而且功能低下，容易引起微血管通透性增高及血脑屏障(BBB)破坏而造成微血管渗漏[28,29]。HGG在肿瘤细胞快速增殖的同时，新生微血管通透性增高与BBB的破坏均有助于Ktrans与Ve的升高。相反，在LGG中，由于细胞增殖不明显，所以现有的微血管通过扩张基本能够满足肿瘤生长所需要的营养与血氧。由于LGG新生微血管很少，所以BBB比较完整，微血管渗漏也不明显，Ktrans与Ve无明显升高。因此，在LGG中，Ktrans与Ve不能反映肿瘤细胞的增殖程度。国内有学者对20例胶质瘤进行DCE-MRI检查发现，Ktrans与Ki-67增殖指数呈正相关[30]。但我们的研究显示，在HGG中Ktrans与Ki-67增殖指数呈正相关，而在LGG中并无相关性。

总之，通过DCE-MRI获得的Ktrans与Ve不仅可以无创地鉴别胶质瘤的分级诊断，而且更有助于评估HGG的细胞增殖程度，能够为胶质瘤的临床诊疗提供重要的参考价值。本次研究还存在一定的局限性。首先由于本次研究属于回顾性分析，所以不能做病理与影像的点对点对照，不能排除抽样误差的可能性，所以我们选择测量胶质瘤Ktrans与Ve最大值与Ki-67增殖指数最大值进行对照研究以最大程度减小误差。其次，样本量相对较小，尤其是仅有8例Ⅲ级胶质瘤。因此，未来还需要继续扩大样本量及精准测量对我们的结果进行验证。