响应面法优化超声辅助提取黑枸杞色素

冯小雨，蔡 瑜，燕雪莹，张雅洁，张 岚

(吉林医药学院公共卫生学院,吉林 吉林 132013)

黑果枸杞(LyciumruthenicumMurr.)是茄科枸杞属多年生灌木植物，藏药称“旁玛”，是中国西北地区的一种珍贵植物资源。果实中含有大量的活性物质，其中黑枸杞色素是主要活性物质之一。该物质溶于水中，具有较强的浸染能力和良好的耐热、耐光、耐酸能力，是一种优良的天然色素资源[1-2]。黑枸杞具有抗氧化、抗疲劳、抗肿瘤、延缓衰老、增强免疫力等功效，因此在食品、医药等方面日益受到重视，极具研究和开发价值。

目前常用的色素提取方法包括溶剂、超声、振荡和微波提取法。黑果枸杞色素的提取方式主要是溶剂提取法，且可供参考文献较多。然而，该方法虽然操作简单、对设备要求较低，但存在提取效率较低、杂质含量高、提取时间长、热不稳定、成分易被破坏等缺点[3-5]，故应与辅助提取方法相结合，以改进提取效果。但目前辅助提取黑果枸杞色素的相关研究相对较少，故本课题利用超声辅助技术对黑果枸杞色素进行提取，结合响应曲面分析，优化提取工艺条件，以期为黑果枸杞色素的研究及利用提供一些参考。

1 材料与方法

1.1 实验材料

黑果枸杞由青海诺木洪黑枸杞农场提供。

FA1104N电子天平(上海精密科学仪器有限公司)，AF-20A型密封式粉碎机(温陵市奥丽中药器械有限公司)，722型可见分光光度计(上海菁华科技有限公司)，KQ-100DB型数控超声清洗器(昆山市超声仪器有限公司)。

1.2 黑果枸杞色素提取和测定

将黑果枸杞放置于50 ℃恒温干燥箱内烘干，用粉碎机粉碎成粉末并过80目筛，黑果枸杞干粉，加入乙醇超声浸提，过滤，在545 nm处测吸光度值。

1.3 黑果枸杞色素提取Plackett-Burman试验设计

通过Plackett-Burman试验对可能影响黑果枸杞色素吸光度值的参数，包括超声温度(t1)、料液比(t2)、乙醇浓度(t3)、超声时间(t4)、超声功率(t5)进行主效应分析，选用N=5的PB设计，每个因素取高(+1)和低(-1)两个水平，以吸光度值为指标，筛选出主要的三个因素。PB试验因素水平设计见表1。

表 1 PB试验因素水平设计表

1.4 最陡爬坡试验

根据PB试验结果，确定3个显著的因素，确定爬坡的方向，选择合理的步长，设计最陡爬坡试验的最佳路径。

1.5 黑果枸杞色素提取Box-Behnken Design优化设计

在PB试验和最陡爬坡试验结果基础上，选择超声温度(A)、料液比(B)、乙醇浓度(C)为因素，采用Box-Behnken Design的设计方案，因素水平表见表2。

2 结果与分析

2.1 Placket-Burman试验结果

黑果枸杞Placket-Burman设计实验及结果如表3。通过效应值的计算，利用Minitab17软件对实验的数据进行因子分析,t检验得到回归方程为：

A=0.493 75-0.029 92×t1+0.050 08×t2+

0.035 08×t3-0.007 92×t4+0.011 75×t5

PB实验分析结果见表4。其S=0.027 077 6,R-Sq =92.95%,R-Sq(调整)=87.08%。表4结果可知在考察的5个因素中t1、t2、t3对色素吸光度的影响显著(P<0.05)。由T值可看出t1、t2、t3、t5均为正效应，即值越高色素的吸光度值越高，t4为负效应，即值越高色素的吸光度值越低。根据P值和T值最终把响应面分析的三个因素确定为t1、t2、t3，即超声温度、料液比、乙醇浓度。

表 4 PB实验分析结果

2.2 最陡爬坡试验结果

根据Placket-Burman试验选择超声温度、料液比、乙醇浓度3个因素，根据2.1结果分析合理设计爬坡方向和步长，确定超声时间5 min，超声功率100 W。试验设计及其结果见表5，可看出随着超声温度、料液比和乙醇浓度的增大，色素吸光度值呈现逐渐增加又逐渐减少的趋势，当超声温度为40 ℃，料液比为1∶30(g/mL)，乙醇浓度为70%时的吸光度值为最高，是3因子的最大影响区域，因此以试验号4的各因素的水平为中心点来设计下一步的响应面实验。

2.3 BBD试验结果

黑果枸杞BBD试验结果见表6，通过回归结果分析得回归方程为：

X=0.700 67-0.024 75A+0.003 63B-0.050 12C-0.050 21A×A-0.080 46B×B-0.042 46C×C+0.007A×B+0.02A×C+ 0.017 75B×C

表 5 爬坡试验设计及结果

表 6 BBD设计及结果

根据回归方程得到超声温度、料液比、乙醇浓度的交互作用对吸光度大小的等高线及3D曲面图，分别见图1、2、3。

由图1所示，曲面陡峭，说明超声温度、料液比交互作用明显，色素吸光度值呈现先增大再减小的趋势，曲面的顶点即为黑果枸杞色素浓度的最高值，等高线接近椭圆，说明两因素间交互作用明显。图2所示，曲面陡峭，说明超声温度、乙醇浓度交互作用明显，色素吸光度值呈现先增大再减小的趋势，等高线接近椭圆，也说明两因素间交互作用明显。图3所示，曲面陡峭，料液比、乙醇浓度交互作用显著，色素吸光度值呈现先增大再减小的趋势，等高线接近椭圆，说明两因素交互作用显著。

图 1 超声温度、料液比对吸光度的影响等高线及3D曲面图

图 2 超声温度、乙醇浓度对吸光度影响等高线及3D曲线图

图 3 料液比、乙醇浓度对吸光度的影响等高线及3D曲线图

3 结 论

通过Placket-Burman设计，从5个影响黑果枸杞色素提取率的因素中筛选出3个影响显著因素，分别是超声温度、料液比、乙醇浓度。通过利用最陡爬坡实验逼近最大响应值区域，然后再利用Box-Behnken设计进一步优化得到了提取效率较好的最佳组合：超声温度为39.65 ℃，料液比为1∶28(g/mL)，乙醇浓度为66.51%，超声时间为5 min，超声功率为100 W，吸光度为0.722 8。同时考虑到了在实际操作的可行性，现将实际组合定为超声温度为40 ℃，料液比为1∶30(g/mL)，乙醇浓度为65%。此时吸光度为0.702与理论接近，说明运用响应面法优化提取黑果枸杞色素的工艺是可靠的。