正交设计优化碱提朝鲜淫羊藿总黄酮的工艺研究

刘茂顺,葛乃嘉,苏益平,张艺琼,陆 钊

(吉林医药学院：1.检验学院,2.公共卫生学院,3.药学院,吉林 吉林 132013)

淫羊藿最早记载于《神农草本经》，属小檗科草本植物，有抗肿瘤、强壮筋骨、祛风湿、补肾壮阳等功效[1]。《中国药典》中收录5种淫羊藿：朝鲜淫羊藿、巫山淫羊藿、箭叶淫羊藿、柔毛淫羊藿以及淫羊藿[2]。朝鲜淫羊藿中总黄酮的提取工艺多采用不同含量的乙醇回流提取法[3-4]，该法存在加热时间过长、提取率较低、提取次数过多的缺点[5-6]。本实验利用碱提酸沉法提取朝鲜淫羊藿中总黄酮，避免了乙醇提取的诸多问题，采用正交设计优化提取工艺条件。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

朝鲜淫羊藿(采自长白山地区，经吉林市药检所鉴定确认)；芦丁对照品(色谱纯，国药集团)；NaOH(分析纯，天津市科密欧化学试剂公司)；Al(NO3)3(分析纯，天津市光复精细化工研究所)；NaNO2(分析纯，天津市大茂化学试剂厂)；甲醇(分析纯，天津市北方天医化学试剂厂)；蒸馏水为本院自制。

紫外可见分光光度计(UV-1800型，日本岛津)；JY2001型电子天平(上海精密科学仪器有限公司)；DK-98-1型电热恒温水浴锅(天津泰斯特仪器有限公司)；KQ-250DE型超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司)。

1.2 供试品溶液的制备

将朝鲜淫羊藿叶除尘清理干净，低温干燥至恒重，粉碎。精密称取粉末5.0 g,置250 mL圆底烧瓶，加100 mL浓度为0.3% NaOH溶液回流提取1 h,提取液浓缩，滤液置于50 mL容量瓶中，50%甲醇定容，即得供试品溶液。取1 mL，按标准曲线方法显色，在510 nm处测定吸光度，计算总黄酮含量。

1.3 对照品溶液的制备

称取105 ℃干燥的芦丁标准品20 mg，置于50 mL容量瓶中，加10 mL 50%甲醇，60 ℃水浴微热溶解，冷却至室温。定容，摇匀，即得0.4 g/L的对照品溶液。

1.4 测定对照品最大吸收峰

精密量取对照品溶液2 mL置于50 mL容量瓶中，加5% NaNO2溶液1 mL。摇匀，放置6 min，加10% Al(NO3)3溶液1 mL，摇匀，放置6 min，加入50%甲醇至10 mL，最后加4%NaOH溶液10 mL，放置15 min，50%甲醇定容，摇匀。另取同样体积的50%甲醇作为空白，紫外分光光度计光谱扫描。

1.5 线性关系考察

精密吸取对照品溶液1.0、2.0、3.0、4.0、5.0 mL分别置于50 mL容量瓶中，按照标准曲线法显色处理，于510 nm处测量吸光度值。以芦丁对照品溶液浓度为横坐标、吸光度为纵坐标做标准曲线。

1.6 单因素实验考察

经预实验，发现影响提取量的主要因素有NaOH浓度、提取时间、提取次数、料液比。通过对上述单因素实验考察确定各因素作用范围，为朝鲜淫羊藿总黄酮提取正交实验提供数据。

1.6.1NaOH浓度对总黄酮提取量的影响

精密称取5.0 g粉碎过筛好的朝鲜淫羊藿粉末5份，分别置于5只250 mL圆底烧瓶中。选取NaOH溶液浓度为0.1%、0.2%、0.3%、0.4%、0.5%，溶液回流提取1 h，得到粗提取液。量取1 mL，50%甲醇定容至10 mL，按标准曲线方法显色，于510 nm处测定吸光度值，平行测试3次，取平均值，计算总黄酮含量。

1.6.2提取时间对总黄酮物含量提取的影响

精密称取5.0 g粉碎过筛好的朝鲜淫羊藿粉末5份，分别置于5只250 mL圆底烧瓶中，分别加100 mL 0.3% NaOH溶液回流提取1、1.5、2、2.5、3 h，得到粗提取液。取1 mL，按标准曲线方法显色，定容至10 mL于510 nm处测定吸光度值，平行测试3次，取平均值，计算总黄酮含量。

1.6.3提取次数对总黄酮物含量提取的影响

精密称取5.0 g粉碎过筛好的朝鲜淫羊藿粉末5份，分别置于5只250 mL圆底烧瓶中，分别加100 mL 0.3 % NaOH溶液回流提取1 h，提取5次合并各粗提取液。取1 mL按标准曲线方法显色,定容至10 mL,于510 nm处测定吸光度值，平行测试3次取平均值，计算总黄酮含量。

1.6.4料液比对总黄酮物含量提取的影响

精密称取5.0 g粉碎过筛好的朝鲜淫羊藿粉末5份，分别置于5只250 mL圆底烧瓶中，选取料液比为1∶20、1∶30、1∶40、1∶50、1∶60(g/mL)浓度为0.3% NaOH溶液回流提取1 h，得到粗提取液。量取1 mL，定容至10 mL，按标准曲线方法显色，于510 nm处测定其吸光度值，平行测试3次，取平均值，计算总黄酮含量。

1.7 朝鲜淫羊藿总黄酮碱提取正交试验

选择提取次数、料液比、提取溶剂(NaOH浓度)、提取时间为考察因素，参考单因素试验结果，以朝鲜淫羊藿样品中的总黄酮含量为指标，选用L9(34)正交表设计试验方案确定朝鲜淫羊藿碱提取的最佳工艺条件[7]。

1.8 浓缩比例和酸用量条件考察

1.8.1浓缩比例对朝鲜淫羊藿总黄酮物含量的影响

称取干燥朝鲜淫羊藿粉末25 g，根据正交实验的最优方案进行提取。将所得提取液平均分成5份，其中4份提取液按照料液比为2∶1、3∶1、4∶1、5∶1(g/mL)浓缩，剩余1份不做浓缩处理。用1 mol/L盐酸调节pH至3。静置12 h后，量取1 mL，定容至10 mL，按标准曲线方法显色，于510 nm处测定吸光度值(A)，平行测试3次，取平均值，计算总黄酮含量。

1.8.2酸用量对朝鲜淫羊藿总黄酮物含量的影响

称取干燥朝鲜淫羊藿粉末25 g，根据最佳提取工艺方案进行提取，将所得到的提取液浓缩至约400 mL。量取4份50 mL浓缩液，并用1 mol/L盐酸调节pH=1、2、3、4、5，静置12 h后，量取1 mL，定容至10 mL，按标准曲线方法显色，于510 nm处测定吸光度值(A)，平行测试3次，取平均值，计算总黄酮含量。

1.9 方法学考察

1.9.1精密度试验

使用移液管精密量取芦丁对照品溶液1 mL，共5份。按线性关系考察项下方法进行显色操作，并测定吸光度值。

1.9.2稳定性试验

精密称取5.0 g朝鲜淫羊藿粉末，最佳工艺条件提取，提取液按线性关系考察项下方法操作，在0、2、4、8、12 h测定吸光度，计算总黄酮含量。

1.9.3重复性实验

精密称取朝鲜淫羊藿5.0 g 5份，最佳工艺条件提取，提取液按线性关系考察项下方法制备样品后测定吸光度，计算总黄酮含量。

1.9.4加样回收实验

准确称取5.0 g朝鲜淫羊藿粉末，最佳工艺条件提取，量取粗提取液5份，每份1 mL置10 mL容量瓶中，分别加入芦丁对照品溶液(0.2 g/L)0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mL。50%甲醇稀释至刻度，摇匀，按线性关系考察项下方法制备样品后测定吸光度值。

1.10最优条件提取样品总黄酮

精密称取5.0 g粉碎过筛好的朝鲜淫羊藿粉末，按最优工艺条件提取，提取液取1 mL，按标准曲线方法显色，在510 nm处测定吸光度，计算总黄酮含量。

2 结果与分析

2.1 对照品最大吸收峰的紫外光谱扫描结果

图1结果显示，芦丁在510 nm处有较平缓的吸收峰，故确定510 nm为测定芦丁最大吸收波长。

图 1 芦丁紫外光谱扫描曲线

2.2 芦丁标准曲线

芦丁质量浓度X(mg/L)与吸光度Y关系曲线，回归方程和相关系数为y=10.938x+0.002 5(R2=0.999 5)，在1～5 mg/L范围内有良好线性关系。

2.3 提取溶剂对朝鲜淫羊藿总黄酮含量的影响

朝鲜淫羊藿各种溶剂中的含量分别为水：1.96%,0.5%酸水(pH=2)：1.51%,0.2% NaOH：4.33%,0.4% NaOH：3.28%。在碱水(稀NaOH溶液)中提取的总黄酮含量较高，在水中和酸水中提取的含量较低。原因是在碱性条件下黄酮类化合物易开环生成查耳酮型结构，颜色多为黄色、褐色和橙色；在酸性条件下查耳酮重新恢复成闭环结构，颜色消失。所以选择稀NaOH溶液作为提取溶剂。

2.4 单因素实验结果

2.4.1NaOH浓度对总黄酮含量提取的影响

NaOH浓度为0.3%时总黄酮提取效果最好，浓度在0.3%之前，浓度越高提取量越大，在0.3%之后，浓度越高提取总黄酮量反而越少。这是由于NaOH浓度过高时破坏了总黄酮的结构，导致总黄酮提取量减少。故选择碱提朝鲜淫羊藿总黄酮的提取溶剂为0.3%的NaOH溶液。

2.4.2提取时间对总黄酮物含量提取的影响

随着提取时间的增加，朝鲜淫羊藿总黄酮含量是逐渐增大，当时间达到2 h后，增加量没有显著变化。另外随着时间增加杂质含量也会增多，不利于接下来的分离纯化。因此，提取时间在2 h为宜。

2.4.3提取次数对总黄酮物含量提取的影响

随着提取次数的增加，朝鲜淫羊藿总黄酮含量逐渐增加，提取2次后，增加量无显著变化。综合热量、时间、溶剂等因素考虑，2次提取效果最佳。

2.4.4料液比对总黄酮物含量提取的影响

随着料液比的增加总黄酮含量也相应增加，但到比例为1∶40(g/mL)后增加量变化不大，从节约成本角度考虑，选择料液比1∶40(g/mL)为宜。

由此确定正交实验因素水平(表1)。

表 1 正交因素水平表

2.5 正交实验结果

正交实验结果见表2,极差分析可知，碱提取朝鲜淫羊藿中总黄酮的主次影响素为：提取溶剂>提取次数>料夜比>提取时间。方差分析结果表明，因素C(提取溶剂)对提取结果影响最大，其次是因素A(提取次数)，其他因素不明显。根据分析结果，综合工艺成本，简单可行等因素得出最佳提取工艺条件为A2B2C3D2，即提取次数2次，料液比1∶40(g/mL)，提取溶剂为0.3%NaOH溶液,提取时间为2 h。

表 2 正交实验结果与直观分析表

2.6 浓缩比例对朝鲜淫羊藿总黄酮含量的影响

结果显示，浓缩比例提高，总黄酮的含量也随之提高，浓缩比例为1∶4时含量值达到最高点(6.45%)，但随着浓缩比例的继续提高，总黄酮含量开始下降，说明有效物质已经沉降完全。所以选择浓缩比例1∶4作为工艺条件。

2.7 酸用量对朝鲜淫羊藿总黄酮物含量的影响

结果显示，随着溶液pH值增加，而淫羊藿总黄酮的含量也随之增加，在pH=3稳定，且含量最高(6.71%)，但随着pH继续增加总黄酮含量逐渐降低。原因是pH过高时会生成锌盐，以至析出的黄酮类化合物重新溶解，降低含量。所以选择酸沉pH=3作为酸沉淀的工艺条件。

2.8 方法学考察结果

2.8.1精密度试验结果

结果可知，平均值为0.415，RSD为1.6%。说明仪器精密度良好，适用于样品总黄酮含量的测定。

2.8.2稳定性试验结果

结果可知，加入显色剂显色后，供试品在12 h内基本稳定，测得值基本不变。平均数为6.63，RSD为1.12%。

2.8.3重复性试验结果

结果可知,5次测得总黄酮含量分别为6.55%、6.67%、6.57%、6.69%、6.67%，平均含量是6.63%，RSD为1.00%，说明本法重复性良好。

2.8.4加样回收率试验结果

加样回收率试验结果显示,5次测量结果的加样回收率为100.5%，RSD为1.48%。

2.9 最优条件提取样品总黄酮

由最优条件下提取的总黄酮含量为6.67%，与正交试验最高值相当，符合《生药学》[8]紫外-可见分光光度法测量标准：总黄酮含量>5.0%(总黄酮含量1.0%～8.0%)。表明该工艺合理可行，提取的总黄酮含量较高。

3 结 论

本研究选用碱提酸沉法提取朝鲜淫羊藿中总黄酮，利用紫外分光光度法测定其含量。通过单因素筛选主要影响因素，正交试验对提取的最佳工艺条件进行优化，各因素对提取工艺的影响顺序为提取溶剂、提取次数、料液比、提取时间。确定的最佳提取工艺是：提取溶剂为0.3%NaOH溶液，回流提取2次，料液比为1∶40(g/mL)，时间为2 h，浓缩比例1∶4，盐酸调节pH=3，朝鲜淫羊藿总黄酮提取量达6.67%，高于何凌等[9]乙醇提取淫羊藿总黄酮的实验结果。该方法工艺简单易行，准确度较好，稳定性和重复性良好，为朝鲜淫羊藿总黄酮提取提供方法学依据。