利用基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱快速鉴定产气荚膜梭菌

汪琦，王紫薇，赵晓娟，李丹，曹嘉悦，马丹，曾静

(北京检验检疫技术中心，北京,100026)

产气荚膜梭菌(Clostridiumperfringens)属革兰氏阳性产芽孢杆菌，在自然界中分布广泛，是引起各种动物坏死性肠炎、肠毒血症和创伤性气性坏疽的主要病原菌之一[1-2]。人食用了受该菌污染的食品，可能会发生食物中毒事件，出现腹泻腹痛、呕吐、不适等急性胃肠炎症状[3-4]。因此，快速准确鉴定产气荚膜梭菌对于有效防止该菌的污染及污染后病症的防治具有重要意义。

目前，产气荚膜梭菌的分离和鉴定主要采取传统检测方法[5-7]，其中，最重要的生化鉴定实验为牛乳汹涌发酵实验，具有特征性鉴别意义[2,6-7]。 此外，VITEK的ANC卡(生物梅里埃)和16S rRNA基因测序也常用于产气荚膜梭菌的鉴定[8-15]。

基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱(matrix-assisted laser desorption/ ionization time-of-flight mass spectrometry，MALDI-TOF MS)是新近发展起来的里程碑式的微生物快速鉴定技术。通过将待测微生物的特征蛋白指纹图谱与已知微生物的特征蛋白指纹图谱比对实现微生物的快速鉴定。相比现有检测方法，该方法具有操作简单、快速、高通量、准确度高和成本低等优点。目前，该技术已成功运用于各种细菌和真菌的鉴定[11-13,16-19]，国内已利用该技术对铜绿假单胞菌、溶藻弧菌、洋葱伯克霍尔德菌、单核细胞增生李斯特氏菌等进行了鉴定[20-23]，但在产气荚膜梭菌鉴定方面的应用还少有报导，只有黄永禄等用MALDI-TOF MS方法快速检测了从地震伤员创面分离出的3株产气荚膜梭菌[24]。

本文利用MALDI-TOF MS方法对51株产气荚膜梭菌菌株进行鉴定并将鉴定结果与其他常用鉴定方法进行比较，评估该方法是否适用于产气荚膜梭菌的快速准确鉴定。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

1.1.1 实验材料

标准菌株ATCC13124(A型)和ATCC12916(E型)购于美国菌种保藏中心。标准菌株CVCC1125(A型)、CVCC58(C型)、CVCC59(C型)和CVCC81(D型)购于中国兽医微生物菌种保藏管理中心。51株本实验室保存的产气荚膜梭菌分离株。

1.1.2 试剂

PCR引物，上海生工生物有限公司合成；rTaq酶、dNTP，日本Takara公司；细菌基因组DNA提取试剂盒(离心柱型)，北京天根公司；α-氰基-4-羟基肉桂酸(α-cyano-4-hydroxy-cinnamic acid， CHCA)，美国Sigma公司；细菌检测标准品(bacterial test standard，BTS)，德国Bruker公司；甲酸，美国MREDA公司；乙腈(acetonitrile，ACN)，美国赛默飞世尔公司；三氟乙酸(trifluoroacetic acid, TFA)，美国ROE公司；无水乙醇，天津富晨；血平板，美国赛默飞世尔公司；厌氧产气袋、ANC卡，法国生物梅里埃公司；液体硫乙醇酸盐培养基(FTG)，北京陆桥公司。

1.2 仪器与设备

Microflex LT基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱仪，德国Bruker公司；VITEK 2 Compact，法国生物梅里埃公司；PCR仪，美国Applied Biosystems公司；Centrifuge 5424型台式离心机，德国Eppendorf公司；Friocell 222L培养箱，德国MMM公司；厌氧盒，日本三菱公司。

1.3 方法

1.3.1 菌株的活化

将标准菌株和分离菌株划线接种血平板，36 ℃厌氧培养18～ 24 h备用。

1.3.2 MALDI-TOF MS鉴定

1.3.2.1 细菌蛋白处理

常用细菌蛋白处理方式有2种，直接涂抹法和甲酸提取法。直接涂抹法：取少量新鲜培养物，直接涂布在靶板上，形成一均匀的薄层。待菌体干燥后，每个样点覆盖1 μL CHCA基质溶液。干燥后上机鉴定。甲酸提取法：取适量血平板上的新鲜培养物，重悬于300 μL去离子水中。加入900 μL无水乙醇。涡旋振荡后13 000×g离心2 min。倒去上清液，再次13 000×g离心1min。用枪头吸弃上清，室温干燥5 min。加50 ～80 μL 体积分数为70%的甲酸溶液(甲酸的量可根据沉淀的量调整)，吹吸使沉淀充分溶解。加入等体积乙腈，涡旋振荡后13 000×g离心2 min，取1 μL上清液点在靶板上，每个样品点2个点。同时点1 μL BTS标准品溶液用于仪器的校正。室温干燥后每个样点覆盖1 μL CHCA基质溶液。干燥后上机鉴定。

1.3.2.2 上机鉴定

打开FlexControl软件，用BTS样点校准仪器。采集蛋白分子质量范围设为2 000～20 000 Da。用Biotyper RTC软件进行菌株图谱信息的采集和自动鉴定。

1.3.2.3 结果判定

布鲁克MALDI-TOF MS系统的鉴定报告以鉴定结果和鉴定分值的形式体现。鉴定分值反映鉴定结果的可信度。其计算方法为在数据库MSP中寻找待测样品的峰，得到分数A，在样品图谱中寻找数据库MSP中的峰，得到分数B，对比这些峰的峰高、频率等信息，得到分数C。A，B，C满分为1分。鉴定分值为log10(1 000×A×B×C)。鉴定分值的判定标准为：2.300～3.000为可信的种水平的鉴定；2.000～2.299为可信的属水平的鉴定，可能的种水平的鉴定；1.700～1.999为可能的属水平的鉴定；0.000～1.699为不可信的鉴定结果。

1.3.3 VITEK 2 Compact系统鉴定

使用ANC卡进行产气荚膜梭菌的鉴定。用半量生理盐水调整菌液浓度至2.8～3.3麦氏单位，抽真空后上机鉴定。未鉴定为产气荚膜梭菌的菌株需重复鉴定1次。

1.3.4 16S rRNA基因序列测定和比对

1.3.4.1 基因组DNA提取

从血平板上取适量的新鲜细菌培养物，按照细菌基因组DNA提取试剂盒说明书提取DNA，- 20 ℃保存备用。

1.3.4.2 16S rRNA基因扩增和序列比对

16S rRNA基因扩增的PCR反应体系为：10×buffer (含1.5 mmol/L MgCl2)5 μL，dNTP(2.5 mmol/L each)4 μL，rTaq酶(5 U/μL)0.2 μL，引物(10 pmol/μL)，各2 μL，DNA模板1 μL，去离子水补充至50 μL。16S rRNA基因扩增引物序列为LPW58，5′-agg ccc ggg aac gta ttc ac-3′；LPW81，5′-tgg cga acg ggt gag gtt cga tac cag-3′。扩增反应条件为94 ℃ 3 min; 94 ℃ 1 min，55 ℃ 1 min，72 ℃ 2 min，40个循环; 72 ℃ 5 min[10]。PCR 扩增产物长度约1 200 bp。经 1% 琼脂糖凝胶电泳确定特异条带后，送生工生物工程(上海)有限公司测序。利用Blast程序(https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)将测序结果与NCBI数据库中的序列进行比对。

1.3.5 牛乳汹涌发酵实验

按照GB4789.13的5.3.3操作。取血平板上的单克隆，接种FTG培养基，36 ℃厌氧过夜培养后取1 mL接种于含铁牛乳培养基。46 ℃水浴中培养2 h后，每小时观察1次有无“爆裂发酵”现象。5 h内不发酵者为阴性。含铁牛乳培养基使用鲜牛乳配制。每个分离菌株进行2次独立实验，2次独立实验均为阴性的结果记为阴性。

2 结果与分析

2.1 MALDI-TOF MS鉴定结果

2.1.1 样品处理方法的选择

对分离菌株进行鉴定之前，先采用厂家提供的2种样品处理方法(直接涂抹法和甲酸提取法)，对实验室保存的6株代表不同毒素类型的产气荚膜梭菌标准菌株进行处理，比较样品处理方法对鉴定结果的影响，并对MALDI-TOF MS方法的鉴定效果进行初步确认。

结果显示，经2种方法处理的标准菌株都被准确鉴定为产气荚膜梭菌。甲酸提取法的鉴定分值全部在2.300以上，达到了可信的种水平的鉴定。直接涂抹法41.67%(5/12)的鉴定分值在2.300以上，58.33%(7/12)的鉴定分值在1.800 ～ 2.300之间(表1)，表明直接涂抹法虽然有时能得到与甲酸提取法相当的鉴定效果，但鉴定效果不稳定。标准菌株ATCC13124经甲酸提取法和直接涂抹法得到的MALDI-TOF MS图谱见图1。从图谱也可看出，相比直接涂抹法，甲酸提取法得到的图谱基线更平稳，蛋白峰更多，重复性更好。因此，采用甲酸提取法对分离菌株进行处理。

图1 标准菌株ATCC13124直接涂抹法和甲酸提取法的MALDI-TOF MS图谱Fig.1 MALDI-TOF MS spectra of the C. perfringensreference strain ATCC13124 using direct smear method andformic acid extraction method横坐标表示蛋白峰的荷质比，纵坐标表示蛋白峰的相对强度；A，B为直接涂抹法2次重复得到的质谱图；C，D为甲酸提取法2次重复得到的质谱图。

2.1.2 分离菌株的鉴定结果

51株分离菌株的新鲜培养物经甲酸提取法处理后上机鉴定，均被鉴定为产气荚膜梭菌且鉴定分值高于2.300，达到种水平的鉴定。鉴定结果见表2。

2.2 VITEK 2 Compact鉴定结果

51株分离菌株经VITEK鉴定，46株菌鉴定为产气荚膜梭菌，4株菌为无法鉴定(Unidentified Organism)，1株为低分辨率(Low Discrimination)。将未成功鉴定的5株菌重新纯化培养后再次鉴定，3株鉴定为产气荚膜梭菌，2株(cp7和cp8)仍无法鉴定。比较这2株菌2次的生化反应，结果完全相同，说明这可能是VITEK数据库中未收录的生化型。VITEK鉴定结果详见表2。

2.3 16S rRNA基因序列比对结果

51株分离菌株的DNA经PCR后都可以扩增出大小约为1 200 bp的目的片段。将测序所得序列在NCBI中做Blast比对，结果均为产气荚膜梭菌(表2)。

2.4 牛乳汹涌发酵实验

牛乳汹涌发酵实验结果显示，32株菌2次实验的结果皆为阳性，15株菌2次实验中有1次结果为阳性，4株菌(cp18，cp27，cp38和cp41)2次实验结果均为阴性。这4株菌的16S rRNA测序、VITEK和MALDI-TOF MS 3种方法的鉴定结果均为产气荚膜梭菌(表2)。

表2 51株分离菌株的MALDI-TOF MS、16S rRNA序列比对、VITEK 2 Compact和牛乳汹涌发酵实验结果Table 2 Identification results of the 51 isolated C. perfringens strains using MALDI-TOF MS, 16S rRNA sequencing,VITEK 2 Compact and iron-milk presumptive test

注：+代表牛乳汹涌发酵实验阳性；-代表牛乳汹涌发酵实验阴性。

3 讨论

产气荚膜梭菌是一种重要的致病菌，引起细菌性食物中毒的数量在美国排第2位[25-26]。在我国，生的肉制品、水产品中也存在较严重的产气荚膜梭菌污染[3,27]。因此，快速准确的鉴定方法对于产气荚膜梭菌的日常检测具有重要意义。

本文中，用新近发展起来的MALDI-TOF MS方法鉴定了实验室保存的51株产气荚膜梭菌，并将鉴定结果与16S rRNA基因序列比对方法、VITEK方法和牛乳汹涌发酵实验等3种常用方法进行比较。实验结果表明，VITEK和牛乳汹涌发酵实验在鉴定产气荚膜梭菌时都出现了假阴性的结果，用MALDI-TOF MS方法鉴定产气荚膜梭菌更加准确(表2)。

VITEK 2鉴定梭菌属细菌时会出现假阴性的结果在多篇文献中已有报道。AlMogbel用MALDI-TOF MS方法和VITEK2鉴定梭菌属的144株菌并以16S rRNA测序方法为参考，结果发现16S rRNA测序鉴定为产气荚膜梭菌的97株菌中，95株被MALDI-TOF MS方法鉴定为产气荚膜梭菌，而VITEK 2只鉴定出78株。VITEK 2对144株梭菌属细菌鉴定的正确率为77.7%(112/144)，错误率为9.7%(14/144)，12.5%(18/144)的菌无法鉴定[11]。有些研究报道的VITEK 2鉴定梭菌属细菌的正确率甚至更低，只有44.4%和64.3%[8-9]。

样品处理方式会影响MALDI-TOF MS方法的鉴定结果。CHEAN用布鲁克的MALDI-TOF MS系统对52株梭菌属的菌株，包括30株产气荚膜梭菌和22株梭菌属的其他菌种进行鉴定，结果表明直接涂抹法处理后鉴定正确率只有69.2%，而甲酸提取法处理后鉴定正确率为100%[12]。本实验中，也采用这2种常见的样品处理方法对标准菌株进行处理，鉴定结果表明，样品处理方法对鉴定结果的影响主要体现在鉴定分值上。直接涂抹法操作简单，虽然有时也可以得到2.300以上的鉴定分值，但是由于涂抹的菌量和均匀程度很难把握，直接导致采集到的图谱质量不稳定，鉴定分值的差异较大(表1和图1)。总体来说，甲酸提取法的鉴定结果在稳定性和重复性上都高于直接涂抹法。选用甲酸提取法可以保证MALDI-TOF MS的鉴定结果更准确。

除了准确性，在检测成本和速度上，MALDI-TOF MS方法也具有不可比拟的优势。VITEK检测1个菌株的成本在30～40元左右，大约需要8 h。而且在检测前需要对菌株进行革兰氏染色从而选择相应的检测卡。而MALDI-TOF MS方法不需要知道菌株的相关信息，检测1个菌株的成本大约为1～2元，0.5 h内可以得到鉴定结果。与传统的牛乳汹涌发酵实验相比，MALDI-TOF MS方法不仅检测时间大大缩短，从6～7 h缩短至0.5 h内，而且结果稳定，便于判断。由于成本低，操作简单，在实际检测过程中，还可以通过筛选更多的可疑菌落提高鉴定结果的准确性。

综上，相比传统检测方法，MALDI-TOF MS方法操作更简便、成本更低廉，检测时间更短，而且结果更加准确，可以作为产气荚膜梭菌日常检测的有效工具。