贺兰山东麓不同陈酿年份赤霞珠干红葡萄酒中酚类物质对涩感质量的影响

李辉，张静，李超，孟哲，周艳芬，张军翔,2*

1(宁夏大学 农学院，宁夏 银川，750021) 2(宁夏大学 葡萄酒学院，宁夏 银川，750021)3(宁夏大学 化学化工学院，省部共建煤炭高效利用与绿色化工国家重点实验室，宁夏 银川，750021)4(贺兰晴雪酒庄，宁夏 银川，100020)

葡萄酒的陈酿可以修饰葡萄酒的感官特性，使葡萄酒的品质得到提升。瓶内陈酿是葡萄酒陈酿环节的一部分，在瓶储过程中葡萄酒会发生一系列反应，包括增加葡萄酒颜色的稳定性、澄清度以及形成更加复杂的酚类物质[1]。在瓶储期间葡萄酒的感官品质也会得到提升，比如会增加一些独特的香气[2-3]，口感会更加的圆润，同时橡木味和涩感的强度会降低。酚类物质是葡萄酒中的重要成分，对葡萄酒的感官特性比如颜色、涩感、苦味还有香气都有直接或者间接的影响[4-6]。而在储藏期间，许多因素比如温度、光照、瓶子摆放位置、氧气含量、陈酿时间长短等都会影响酚类物质的成分[7]。因此大部分酚类成分不稳定并且在陈酿期间会发生一系列化学反应，尤其是氧化和聚合反应。单宁是葡萄酒中非常重要的酚类物质，对葡萄酒的稳定性和感官质量都有着重要作用。比如单宁和花色苷直接结合或者通过乙醛桥连接形成稳定的单宁—花色素复合物从而使葡萄酒的颜色更加稳定。优质干红葡萄酒中的优质单宁带来的涩感可以使葡萄酒的口感更加的圆润有结构感，目前国内对于葡萄酒涩感的评价大部分都是葡萄酒的单一涩感强度，但这并不能说明涩感质量的好坏，GAWEL[8]就将涩感描述为天鹅绒般的(velvet)、干燥的(drying)、皱褶的(pucker)等，本实验通过品评小组对葡萄酒的干涩和绒涩进行了评价，从而对赤霞珠干红葡萄酒中酚类物质涩感质量的好坏进行更细致的研究。有许多文章对短期陈酿过程中葡萄酒的酚类物质[9-10]、颜色[11]、香气[12]进行了报道，但对于葡萄酒长时间陈酿过程中酚类物质及涩感的变化报道却很少，本文对来自同一酒庄，相同酿造工艺，同一瓶储环境，2005—2006年和2008—2015年10个不同陈酿年份的赤霞珠干红葡萄酒的总酚、总单宁、总花色苷、儿茶素、表儿茶素、表棓儿茶素、表儿茶素没食子酸酯、原花青素B1、B2和(表)儿茶素三聚体、涩感质量进行了量化分析，统计分析涩感质量与多酚成分之间的相关性，以期对葡萄酒的陈酿技术提供一些理论指导。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

酒样：实验选用宁夏贺兰山东麓贺兰晴雪酒庄10个年份的赤霞珠干红葡萄酒，分别是2005、2006年份、2008—2015年份。所有的葡萄酒均是陈酿型葡萄酒，在橡木桶陈酿12个月后装瓶，并在相同酒窖进行陈酿(温度12～18 ℃，相对湿度60%～80%)。

试剂：儿茶素(+)-catechin(C)、表儿茶素(-)-epicatechin (EC)、表棓儿茶素(-)-epigallocatechin (EGC)、表儿茶素没食子酸酯(-)-epicatechin-3-O-gallate (ECG)(纯度>98%)，上海源叶生物科技有限公司；原花青素B1[(-)-epicatechin-(4β-8)-(+)-catechin]、原花青素B2[(-)-epicatechin-(4β-8)-(-)-epicatechin]、干没食子酸(纯度>98%)，美国Sigma公司；甲醇、甲酸(色谱级)，美国Fisher；Na2CO3、Folin-Ciocalteu试剂、浓盐酸、无水乙醇、硫酸奎宁、Al2(SO4)3、酒石酸、氨水(分析纯)均为国产。

1.2 仪器与设备

Dionex Ultimate 3000 UHPLC 超高效液相色谱仪、配有ESI离子源的LTQ-XL增强型线性离子阱质谱仪，美国Thermo Fisher Scientific公司；Syncronis-C18色谱柱(2.1 mm×100 mm，1.7 μm)，美国Thermo Fisher Scientific公司；KH-250DB型数控超声波清洗器，昆山禾创超声仪器公司生产；实验用水为Milli-Q纯水系统，美国 Millipore公司制备；TGL-16M高速冷冻离心机，湖南湘仪；旋涡混合器QL-866，海门市其林贝尔仪器制造有限公司。

1.3 方法

1.3.1 酒样常规理化指标测定

酒精、pH值、总酸、干浸出物的测定参照国标GB/T 15038—2006

1.3.2 总酚含量测定

Folin-Ciocalteu法[13]

1.3.3 总单宁的测定[14]

先将葡萄酒样品用蒸馏水稀释50倍，取2支具塞试管，分别加入2.0 mL稀释后酒样，1.0 mL蒸馏水，6.0 mL浓盐酸。试管1盖上塞子密闭，用锡箔纸包严防光，沸水浴加热30 min，迅速冷却；试管2在常温下放置30 min。随后在2支试管中加入1.0 mL无水乙醇，在550 nm下测定试管1吸光值A1、试管2吸光值A2，单宁质量浓度(g/L)计算见公式(1)。

ρ(单宁)=(A1-A2)×19.33

(1)

1.3.4 儿茶素、表儿茶素、表棓儿茶素、表儿茶素没食子酸酯及原花青素B1、B2含量测定

取2.0 mL葡萄酒，放入10.0 mL离心管中，置于高速冷冻离心机中，温度设置为8 ℃，12 000 r/min离心20 min，吸取上清液0.1 mL用氨水调节pH至7.0，最后用20%甲醇定容到1.0 mL，漩涡混匀1 min，收集混合液至自动进样瓶，待UHPLC-ESI-MSn分析。

UHPLC色谱条件：采用Syncronis-C18色谱柱(2.1 mm×100 mm，1.7 μm)；流动相 A为体积分数为0.1%甲酸的水溶液，B为甲醇。梯度洗脱：0～15 min，B相体积分数为2%～20%；15～30 min，B相体积分数为20%～40%；30～40 min，B相体积分数为40%～90%；90%B保持5 min；流速：0.3 mL/min；柱温：35 ℃；进样量：10 μL。

质谱条件：负离子采集模式；毛细管电压 3 kV；ESI源毛细管温度320 ℃；辅助气流速10 arb unit，吹扫气流速30 arb unit；多级扫描碰撞气(99.999 9%高纯氦气)；全扫描模式的质量扫描范围m/z50～1 500；定性分析采用全扫描模式，其采集范围m/z100～1 000；定量分析采用选择离子扫描模式。

1.3.5 涩感质量感官分析[15-16]

感官评价小组由9位有葡萄酒感官评价经验的专家组成，为了保证评价标准的一致性在感官分析前先进行感官品评培训，分别利用3.0 g/L单宁、0.1 g/L 奎宁和4.0 g/L酒石酸溶液来辨别涩感与苦味和酸味之间的区别。涩感感官分析在标准的葡萄酒感官实验室进行，常温20 ℃，湿度70%。倒入30.0 mL对应干红葡萄酒酒样，要求品评员喝入口腔内酒样能盖住舌面，轻轻搅动舌头，3～5 s后，轻吸一口气，保持3 s后吐出酒样。要求品尝员选择2个涩感术语(干涩:口腔内干燥的感觉；绒涩:口腔内柔顺丝滑的感觉。)描述葡萄酒样品的涩感。采用5点标度法打分：1分为隐约感觉到，强度最弱；2分为能感觉到，但不强；3分为能清晰地感觉到，中等强度；4分为明显感觉，强度较大；5分为第一印象的感觉，强度最强。2个涩感术语可以多选，最终某一涩感特征的感官量化值MF采用(2)式计算。每品尝过一个酒样用去离子水清洁口腔2次，并咀嚼苏打饼干使味觉得到恢复，且在对下一酒样进行评价前至少等待30 s。每个酒样的评价在5 min内完成。

(2)

式中：MF为感官量化值；F为该特征在品评组中的使用频率，%；I为该特征平均得分在5分制中的强度率，%。

1.4 数据分析

运用SPSS 22.0进行方差分析用于分析不同陈酿年份葡萄酒之间主要理化指标的差异显著性，通过相关分析发掘各主要理化指标和涩感评价相互之间的联系。

2 结果与分析

2.1 常规理化指标分析

表1给出了不同年份葡萄酒酒精度、总酸和pH常规理化指标。可以看出所选酒样酒精度范围在12.5%～15.2%之间，总酸范围为5.0～7.4 g/L，pH范围为3.4～3.7之间。部分年份葡萄酒之间的酒精度、总酸和pH值差异较大。这些差异可能与气候因素有关，也可能与葡萄酒存放过程中酒精的挥发及酒石酸的沉淀有关。另外这些差异可能会对葡萄酒的涩感产生一定的影响。

表1 常规理化指标Table 1 Conventional physical and chemical indicators

注:表中数据表示平均数±标准偏差，同一列不同小写字母表示在0.05水平上差异显著，下同。

2.2 酚类物质分析

表2给出了不同陈酿年份葡萄酒的总酚、总单宁、总花色苷含量。从表2可以看出，2011-2015年5个年份葡萄酒的总酚和总单宁的含量均显著(p<0.05)地高于2005、2006和2010三个年份，随着陈酿年份的增加，总酚和总单宁的含量总体上呈现出下降的趋势。随着陈酿年份的增加总花色苷含量总体上呈现出逐渐降低的变化趋势，由表2可以看到2015年葡萄酒中的总花色苷含量是2005年的十几倍，有报道在橡木桶或瓶内陈酿的最初几年花色苷的含量会急速下降[17]。

表2 总酚总单宁及总花色苷含量Table 2 Total phenolic total tannin and totalAnthocyanidins content

在负离子模式下分别提取6种目标物的离子如图1所示。从图1可以看出儿茶素(C)与表棓儿茶素(EGC)较难分离，因此利用紫外检测器高效液相色谱法难以对它们进行定性定量分析，但通过质谱提取离子的方法可以很好的将他们分开并进行定性定量分析。其他4种目标物在通过C18色谱柱后均得到了有效地分离，峰形比较窄，能够很好地进行定性定量分析。

1-儿茶素C；2-表儿茶素EC；3-表棓儿茶素EGC；4-表儿茶素没食子酸酯ECG；5-原花青素B1；6-原花青素B2，图1 六种标品负离子模式提取离子质谱图Fig.1 Six standard goods anion mode extraction of ionsspectrum

利用优化的前处理方法及UHPLC-ESI-MSn方法测定了10种不同年份的赤霞珠干红葡萄酒中儿茶素、表儿茶素、表棓儿茶素、表儿茶素没食子酸酯、原花青素B1、B2的含量(表3)。根据二级质谱图(图2)并参考文献[18-20]推测在负离子模式下分子离子[M-H]-865m/z失去126(即1个间苯三酚)形成碎片离子m/z739；碎片离子m/z713则是由分子离子[M-H]-865m/z失掉152产生的；分子离子[M-H]-865m/z发生裂解失去290[即1个(表)儿茶素]得到m/z575，碎片离子m/z575进一步失去288[即失去2个氢原子的(表)儿茶素]得到碎片离子m/z287，综上所述推断分子离子[M-H]-865m/z是由3个(表)儿茶素构成的三聚体即(表)儿茶素-(表)儿茶素-(表)儿茶素三聚体，为了方便描述记作Trimer，另外为了方便分析将其含量以儿茶素计，结果如表3。

图2 m/z 865离子的二级质谱图Fig.2 MS2 spectrum of ion at m/z 865

由表3可以看出随着陈酿时间的增加，儿茶素(C)、表儿茶素(EC)、表棓儿茶素(EGC)、原花青素B1、B2、(表)儿茶素三聚体(Trimer)的含量总体呈现逐渐下降的趋势。在本实验检测的10个葡萄酒样品中未检测到表儿茶素没食子酸酯(ECG)。从表3可以看出在黄烷-3-醇低聚体当中二聚体含量最高，通常在葡萄中的黄烷-3-醇寡聚体当中以二聚体最多[21]，其中原花青素B2是葡萄籽的主要成分[22]，而原花青素B1则主要存在于葡萄果皮中。

2.3 葡萄酒涩感质量分析

五点标度打分的结果通过公式计算得出干涩和绒涩的感官量化值分别用MF(干涩)、MF(绒涩)表示。从图3雷达图可以看到总体上陈酿时间较长的赤霞珠干红葡萄酒比陈酿时间较短的MF(干涩)值较低，而MF(绒涩)值较高。另外从雷达图上可以看到干涩突出的年份其绒涩则会比较低，其中最明显的是2008年赤霞珠干红葡萄酒。

表3 黄烷-3-醇单体、原花青素B1、B2及(表)儿茶素三聚体含量 单位：mg/L

注：“-”表示未检测到

图3 葡萄酒涩感质量感官评价雷达图Fig.3 Astringency quality evaluation radar chart of wines

2.4 主要理化指标及涩感质量相关性分析

对相关理化指标及涩感评价进行相关分析结果如表4所示，从表4可以看总酚和总单宁的含量极显著正相关(p<0.01)；干涩与绒涩极显著负相关，说明在葡萄酒陈酿过程中绒涩的上升伴随着干涩的下降。葡萄酒的干涩与总酚及总单宁的含量正相关，绒涩与总酚及总单宁的含量负相关，但并没有显著的相关性(p>0.05)，说明在葡萄酒陈酿过程中总酚及总单宁的含量变化并不是引起葡萄酒涩感质量变化的主要因素。儿茶素C、表儿茶素EC、表棓儿茶素EGC及原花青素B1、B2与干涩强度显著正相关(p<0.05)；Trimer与干涩极显著正相关。儿茶素C、表儿茶素EC、表棓儿茶素EGC、原花青素B1、B2、Trimer之间极显著正相关。总酚与Trimer显著正相关，总单宁与原花青素B1、B2、Trimer显著正相关。

表4 理化指标及涩感质量相关矩阵Table 4 Correlation analysis of physical and chemical indexes and astringency evaluation

注：**在 0. 01 水平( 双侧) 上显著相关; * 在 0. 05 水平( 双侧) 上显著相关

3 讨论

葡萄酒的涩感会受到pH值、总酸、酒精度等多种因素的影响，有研究通过模拟酒样[23]证明pH值在3.5和4.0之间(红酒pH)变化对涩味没有显着影响；另外，在恒定pH值下酒石酸浓度(2～6 g/L)的变化对收敛无影响；但是在同一研究中，当提高乙醇水平时(8%、11%和14%)，涩感强度会降低，虽然乙醇有助于柔化多酚涩味[24]，但对涩感的影响较小[25]。本研究分析了10个不同陈酿年份系列赤霞珠干红葡萄酒的总酚、总单宁、总花色苷及儿茶素C、表儿茶素EC、表棓儿茶素EGC、表儿茶素没食子酸酯ECG、原花青素B1、B2和(表)儿茶素三聚体(Trimer)的含量并进行了感官分析。结果表明随着陈酿年份的增加总酚、总单宁及总花色苷的含量呈逐渐降低的趋势，这与CHIRA[26]的研究结果一致。相关性分析结果表明葡萄酒的干涩及绒涩与总酚、总单宁的含量并没有显著的相关性，干涩与儿茶素、表儿茶素、表棓儿茶素及原花青素B1、B2显著正相关(p<0.05)，(表)儿茶素三聚体(Trimer)与干涩极显著正相关(p<0.01)。PELEG[27]系统的研究了黄烷-3-醇单体、二聚体、三聚体的苦味及涩味，发现从单体到三聚体随着聚合度的增加其涩味逐渐增强。本研究也说明了在葡萄酒陈酿过程总酚和总单宁含量的变化并不是引起涩感质量变化的主要因素，最主要的因素还是酚类物质结构的差异[26, 28-29]；儿茶素C、表儿茶素EC、表棓儿茶素EGC、原花青素B1、B2、Trimer之间极显著正相关(p<0.01)，这在一定程度上说明这些物质的关系极为紧密，亲核的黄烷-3-醇和亲电的黄烷-3,4-二醇，通过C4—C8或C4—C6共价键连接可以形成寡聚物或者多聚物[18]。干涩与绒涩极显著负相关，研究中并没有发现与绒涩显著相关的理化指标，可能是因为绒涩主要与聚合度高的单宁有关，但聚合度大于5的单宁就难以分离所以本实验并没有发现与绒涩显著相关的单宁，如何对聚合度更高的单宁进行有效的分离还需要进一步的研究。

4 结论

对宁夏贺兰山东麓10个不同年份赤霞珠干红葡萄酒的酚类物质及感官评价分析结果表明，赤霞珠干红葡萄酒在陈酿过程中总酚、总单宁、总花色苷的含量会降低，小分子酚类物质的含量也会减少。在赤霞珠干红葡萄酒陈酿过程中干涩降低，绒涩增加。干涩和绒涩与总酚及总单宁的含量没有显著的相关性。葡萄酒的干涩与儿茶素、表儿茶素、表棓儿茶素及原花青素B1、B2显著正相关，(表)儿茶素三聚体(Trimer)与干涩极显著正相关，但并没有发现与绒涩显著相关的理化指标。