赤雹根总皂苷对大鼠肿瘤坏死因子-α表达的影响

田沂凡 佟继铭 马 帅 李忠思 刘永平

(河北省中药开发与研究重点实验室 承德医学院中药研究所，河北 承德 067000)

赤雹根味苦性寒，功能活血祛瘀，清热解毒，是葫芦科多年蔓生草本植物赤雹的成熟块根，是我国满族民间药材，经常被用于治疗风湿腰腿痛、软组织损伤，疗效显著，而且没有明显毒副作用〔1〕。类风湿关节炎(RA)是一种自身免疫功能障碍性疾病，以侵蚀性关节损害为主，并伴随其他系统受累的慢性炎性疾病，全球成人的发病率为0.5%～1.0%〔2〕。由于目前RA病因尚未确切，患者得不到临床治愈，经常应用抗风湿药物，几年后会出现明显的毒副作用，多数患者的病情得不到满意控制〔3〕，研究药效高而且毒副作用小的抗RA药物为临床之急需。前期研究表明，赤雹根总皂苷(TSTR)对诱导性关节炎(AA)大鼠有较好的治疗作用〔4，5〕，本实验前期研究基础上，探讨TSTR对AA大鼠肿瘤坏死因子(TNF)-α的影响。

1 材料与方法

1.1药物与试剂 TSTR提取所用赤雹根，经承德医学院赵春颖教授鉴定为葫芦科植物赤雹的干燥块根，TSTR由承德医学院中药研究所药理实验室提取，纯度为55.2%；雷公藤多苷(TG)片(安徽新陇海药业有限公司，批号 100301)；酶联免疫吸附试验(ELISA)试剂盒(武汉博士德生物科技有限公司，批号EK0526)；弗氏完全佐剂(FCA，美国Sigma公司，批号100M8725)；聚合酶链反应(PCR)试剂盒(大连宝生物工程有限公司，批号BK4501)；PCR扩增引物(美国Invitrogen 生命技术公司，批号HB120706536)；兔抗鼠TNF-α一抗(美国Bioworld公司)；免疫组化试剂盒(北京四正柏生物科技有限公司)；其他试剂均为国产分析纯。

1.2仪器 CSR-1-30型超纯水机(北京爱思泰克科技开发有限责任公司)；YXQ-LS-30 SⅡ立式压力蒸汽灭菌器(上海博迅实业有限公司医疗设备厂)；DU800紫外可见分光光度计(美国Beckman Coulter公司)；iCycler PCR仪(美国Bio-rad公司)；SIM-F124制冰机(日本SANYO公司)；ESJ200-4电子天平(沈阳龙腾电子有限公司)；TK-218型恒温摊片烤片机(湖北泰维医疗科技有限责任公司)；YKH-I型液体快速混合器(江西医疗器械厂)；RM2125型常规轮转石蜡切片机(德国Leica公司)；BH-2型Olympus显微镜及摄像装置(日本Olympus公司)。

1.3动物 SPF级，雄性8周龄SD大鼠60只，体重180～200 g，购自北京华阜康生物科技股份有限公司，合格证号：SCXK京2009-0007。

1.4方法

1.4.1AA模型的制备 随机数字表法取大鼠10只作为空白组，其余大鼠均于右后足跖部皮下注射FCA 0.1 ml，以注射点周围出现明显白泡为效果最佳，于注射FCA后第18天，关节炎指数(AI)≥6为模型建立成功。AI评判标准：肢体关节肿胀按0～Ⅳ级评分〔6〕。0级：无红肿；Ⅰ级：指关节稍肿；Ⅱ级：小趾关节及足趾关节肿胀；Ⅲ级：踝关节以下足爪肿胀；Ⅳ级：包括踝关节在内的全部足爪肿胀。AI=四肢肢体关节肿胀级评分之和(Ⅰ级为1分，总分为16分)。AI≥6的大鼠为模型建立成功。

1.4.2分组及给药 将模型大鼠随机分为模型组、TSTR 40，80，160 mg/kg组和TG 12 mg/kg对照组，各药物组均灌胃给予相应药物21 d，空白组和模型组给予等体积蒸馏水灌胃。

1.4.3ELISA检测AA大鼠血清TNF-α水平 腹主动脉取血，静置30 min以上，3 500 r/min离心10 min，取上清，将血清注入EP管中4℃保存备用。按照ELISA试剂盒说明书检测血清TNF-α含量。

1.4.4逆转录(RT)-PCR法测定足跖部TNF-α mRNA表达 取新鲜足趾100～200 mg，加入1 ml Trizol，置于匀浆器中，冰上充分研磨，匀浆液于离心机(4 ℃、 12 000 r/min，15 min)离心后，取上清液，加入0.2 ml三氯甲烷，剧烈震摇30 s，静置5 min；同等条件再次离心后，小心吸取上清水相液(勿吸入中间蛋白层)，加入等体积异丙醇，上下缓慢颠倒几次，使之混匀，-20℃冰箱静置2 h后，冰上放置5 min；再次相同条件离心，留取管壁侧部和底部的白色RNA沉淀，用75%乙醇〔0.1%焦碳酸二乙酯(DEPC)水配制〕1 ml，洗涤沉淀，重复3次，将洗涤后的RNA溶于20 μl DEPC水中，放置-80℃冰箱，保存备用。取少量待测RNA样品，用DEPC水稀释100倍，紫外分光光度计测定RNA纯度，琼脂糖凝胶电泳法检测RNA完整性，反转录合成cDNA(反转录程序为：30℃，10 min；42℃，30 min；99℃，5 min；5℃，5 min)产物cDNA于-20℃保存。PCR扩增程序为：94℃预变性2 min，94℃变性30 s，57℃退火30 s(不同目的因子采用相应的退火温度)，72 ℃延伸1 min，共30个循环，产物于-20℃保存。TNF-α上游引物5′-CGTCGTAGCCAAACCACCAAG-3′，下游引物5′-CACAGAGCAATGACTCCAAAG-3′，扩增长度426 bp，退火温度57℃；β-actin上游引物5′-CATCCTGCGTCTGGACCT-3′，下游引物5′-TCAGGAGGAGCAATGATCTTG-3′，扩增长度480 bp，退火温度53℃反应液依照试剂盒说明书配制同PCR反应产物分析：配制含EB 0.5 μg/ml的2%琼脂糖凝胶，取4 μl PCR产物与1 μl 5倍DNA上样缓冲液混匀，将电泳仪调至120 V，25 min，将电泳结束后的凝胶移至紫外透射仪下，观察并摄取图像。应用Quantity One4.6.2凝胶定量分析软件测定图像的光密度值(IOD)，进行定量分析。计算各目的条带与β-actin条带光密度的比值(ROD)。

1.4.5免疫组化法测定脾脏TNF-α蛋白表达水平 将取材后的大鼠脾脏于10%甲醛固定液固定48 h后，常规脱水、石蜡包埋、切片(免疫组化步骤按试剂盒说明书进行)、10×20倍光镜下观察TNF-α高蛋白表达情况，并拍摄图像；其中以细胞质中出现颗粒状淡黄色或褐黄色者为阳性细胞。采用IPP6.0软件测定足跖部TNF-α表达的免疫组化染色的IOD值，计算各组光密度平均值，进行半定量分析。阴性对照片用磷酸盐缓冲液(PBS)代替一抗，其余操作步骤同上。

1.5统计学方法 采用SPSS19.0统计软件进行单因素方差分析。

2 结 果

2.1各组血清TNF-α水平比较 模型组血清TNF-α 含量〔(0.98±0.08)ng/ml〕明显高于空白组〔(0.15±0.03)ng/ml,P<0.01〕；TSTR 40,80,160 mg/kg组血清TNF-α 含量〔(0.56±0.05)、(0.32±0.04)、(0.18±0.04)ng/ml〕明显低于模型组(P<0.01)；TSTR 40 mg/kg组和80 mg/kg组血清TNF-α 和TG对照组〔(0.15±0.03)ng/ml〕比较差异有统计学意义(P<0.05)，治疗RA效果弱于TG对照组；TSTR 160 mg/kg组血清TNF-α 和TG对照组比较差异无统计学意义(P>0.05)。

2.2各组足跖部TNF-α mRNA表达比较 各组内参β-actin mRNA表达较为均一，空白组TNF-α mRNA表达较少(0.1±0.02)。各药物组TNF-α mRNA表达均明显低于模型组(0.665±0.099，P<0.05或P<0.01)；其中TSTR 40 mg/kg组(0.299±0.054)和TSTR 80 mg/kg组(0.27±0.045)大鼠TNF-α mRNA表达和TG对照组(0.162±0.036)比较差异有统计学意义(P<0.05)，治疗RA效果弱于TG对照组；TSTR 160 mg/kg组TNF-α mRNA表达(0.077±0.01)和TG对照组比较差异无统计学意义(P>0.05)。见图1。

A～F:空白组、模型组、TSTR 40 mg/kg组、TSTR 80 mg/kg组、TSTR 160 mg/kg组、TG对照组图1 各组足跖部TNF-α mRNA

2.3各组脾脏TNF-α蛋白表达水平比较 与空白组(0.09±0.02)相比，模型组(1.52±0.28)脾脏TNF-α蛋白表达水平明显升高(P<0.01)；与模型组比较，TSTR各剂量组TNF-α表达水平均明显降低(P<0.05或P<0.01)；其中TSTR 40 mg/kg组和80 mg/kg组TNF-α表达水平(1.01±0.22，0.54±0.13)和TG对照组(0.39±0.11)比较差异有统计学意义(P<0.05或P<0.01)，治疗RA效果弱于TG对照组；TSTR高剂量组TNF-α 表达(0.47±0.15)和TG对照组比较差异无统计学意义(P>0.05)；见图2。

3 讨 论

RA是一种以慢性、侵蚀性关节滑膜炎为特征的自身免疫性疾病。目前为止，医学界还没有攻克RA这一世界性的难题，通常认为与T细胞免疫反应和B细胞产生自身抗体均有关，但其具体发病机制尚不清楚。RA患者中炎性细胞因子异常活跃已得到公认，特别是由单核巨噬细胞产生的TNF-α与RA的发病密切相关〔7，8〕。TNF-α不仅可以通过自分泌的形式进行细胞的调节和体液免疫，还可以通过旁分泌的形式在早期的RA中扮演着重要的角色〔9〕，肖金鱼等〔10〕在RA患者滑液和血清中，检测出TNF-α 表达水平显著增高。在对RA模型大鼠炎症组织的实验研究中发现，引起大鼠关节肿胀及滑膜损伤的重要因素是大量TNF-α 和IL-1β的表达〔11〕。TNF-α对RA滑膜细胞凋亡也有重要影响〔12，13〕，从而加重关节炎的发病。而且TNF-α对前列腺素(PG)E2和胶原酶的合成也起到了关键作用，能引起骨和软骨吸收的破坏，促进纤维细胞增生〔14〕；TNF-α的分泌对巨噬细胞的产生也起到刺激和加速形成的作用〔15〕，巨噬细胞又通过激活关节腔血管内皮细胞增强黏附分子的表达，促进软骨细胞合成释放前列腺素和胶原酶，引发关节腔及滑膜炎症反应〔16〕，参与RA的免疫病理损伤过程；而软骨基质的崩解容易诱发TNF-α的合成，形成正反馈系统，加重TNF-α在RA活动期的滑囊炎和骨损坏过程中所起的决定性作用。TNF-α还促进炎性因子IL-1β的合成和分泌，各种炎症因子的表达相互促进，形成恶性循环。

RA是一种反复发作性、以肢体小关节疼痛为主要病症的疾病，传统医学中多把此类病症归为“痹证”范畴，虽然没有RA这一病名，但是从患者体征、临床症状等，可以看出古代医家对该病认识由来已久。《黄帝内经》中就提出了“痹”病，如《素问·逆调论》所云“……病名曰骨痹，是人当挛节也”。东汉张仲景在《金匮要略·痉湿暍病脉证》中指出“病者，一身尽疼，发热，日晡所剧者，名风湿”。古代医家多认为气血不足，营卫失调是此病发生的重要内因，风寒湿热之邪是本病发生的重要外因，治疗的原则多从这几个方面辨证施治，遣方用药。中药雷公藤功效祛风除湿、通络止痛，从雷公藤中提取制备的TG片具有较强的抗炎及免疫抑制作用，长期以来在用于治疗RA方面疗效显著，但是近年来发现其毒副作用较大，寻找毒副作用小，疗效显著的抗RA药物尤为迫切。赤雹为少数民族长期沿用药材，课题组前期已经证明了TSTR对大鼠AA有治疗作用〔17,18〕，可以减轻大鼠AA滑膜炎症反应，也证实了TSTR发挥镇痛的主要作用机制与抑制NO和PGE2的合成和释放有关〔19〕，推知TSTR发挥作用的机制也可能与抑制TNF-α的活性有关。本实验证明TSTR对RA的治疗可能是通过抑制TNF-α活性而发挥作用。