缺氧预处理骨髓间充质干细胞移植联合清热化瘀方对脑缺血损伤大鼠血管新生的影响

胡跃强 甘业贤 梁 妮 陈 炜 秦红玲 唐 农

(广西中医药大学第一附属医院，广西 南宁 530023)

迄今为止，尽管溶栓、支架植入等血管内治疗日益成熟，能显著提高脑梗死患者的成活率，但不能使已经坏死的神经元再生。随着骨髓间充质干细胞(BMSCs)移植和分化等技术的日渐成熟，为病损神经元的重建提供了全新策略〔1〕，但其移植后在宿主内的存活率和分化率不高，使其疗效难达满意〔2〕。而缺氧预处理(HP)作为目前提高干细胞移植效果的新兴方法在许多细胞系已被证实〔3，4〕。以“浊毒”和“瘀血”为病机创制的清热化瘀方，具有解毒降浊、活血化瘀的功效，前期动物实验表明该方治疗脑梗死的效果显著〔5～7〕。本实验通过研究清热化瘀方联合HP-BMSCs移植对大鼠血管内皮生长因子(VEGF)表达及血管新生的影响，旨在探讨其神经保护的部分作用机制。

1 材料和方法

1.1实验动物与分组 健康3月龄雄性SD大鼠216只(SPF级，广西医科大学动物实验中心提供，动物许可证号：SCXK桂2014-0002)，体重(250±50)g，随机分为假手术组(SO)、模型组(MCAO)、BMSCs移植对照组(N-BMSCs)、经HP后的BMSCs移植组(HP-BMSCs)、BMSCs移植联合清热化瘀方组(BMSCs+QRHY)、HP-BMSCs移植联合清热化瘀方组(HP+QRHY)各36只，根据细胞移植后取材时间点(7、14、28 d)，将每组再分3个亚组(n=12)。

1.2实验药物及主要仪器试剂 ①实验药物：清热化瘀方：水牛角30 g、丹参15 g、地龙10 g、赤芍15 g、川芎10 g、郁金10 g、石菖蒲10 g、天竺黄10 g、酒大黄6 g，给予本方浓缩颗粒剂按1.4 ml/100 g体重浓度灌胃，其浓度及等效剂量按人和动物间体表面积比值表折算。②主要试剂及仪器：L-DMEM培养基(上海Gibco/Hyclone公司)，优级胎牛血清、淋巴细胞分离液 (天津灏洋生物有限公司)，兔抗VEGF(BioVision)，倒置荧光相差显微镜(日本OLYMPUS)，免疫组化试剂盒(北京中杉)，TUNEL试剂盒(Roche)，CD31/PECAM-1 Antibody(NB100-2284)。

1.3BMSCs的培养、鉴定及HP方法 ①MSCs培养：采用全骨髓贴壁培养常规方法分离获得3周龄SD大鼠BMSCs，并按1∶3 的比例传代培养，收集第4代细胞，调整其浓度为106个/ml。②BMSCs鉴定：取第4代BMSCs，加入TITC荧光标记的抗CD34、CD45、CD90抗体，予流式细胞技术检测细胞表面抗原标记率。③HP方法：将BMSCs按1∶3 的比例传代培养达80%融合，换液后进行HP，在ProOx-C-chamber系统(Biospherix，Redfield，NY，USA)中设置调控缺氧浓度为0.5%，缺氧时间24 h。

1.4动物造模及药物干预方法 SO组线栓只插入颈内动脉9 mm；参照改良的Longa线栓法〔8〕建立脑缺血再灌注(I/R)模型，缺血2 h后拔出栓线进行再灌注；N-BMSCs和HP-BMSCs组再灌注后24 h经颈内动脉分别给予BMSCs、HP-BMSCs悬浮液200 μl，细胞数2×106个/ml，并予同等体积的生理盐水灌胃；BMSCs+QRHY和HP+QRHY组再灌注前4 d给予清热化瘀方颗粒剂灌胃(14 g·kg-1·d-1)，1次/d，待动物清醒后继续灌胃。其浓度及等效剂量按人和动物间体表面积比值表折算。

1.5大鼠神经功能缺损评分(NSS) I/R大鼠NSS按改良神经功能评分法〔9〕在细胞移植各时间点处死实验大鼠前评分，总分18分，评分越低表明神经功能损伤越轻。

1.6TUNEL法检测缺血半暗带细胞凋亡 参照试剂说明书进行操作。光学显微镜下观察标本缺血半暗带区域，被试剂染成棕褐色的细胞为凋亡细胞，每张切片任意选取4个视野(×400)，取平均值作为测定值并计算出阳性细胞数。

1.7Western印迹检测缺血半暗带VEGF蛋白表达 ①蛋白样品收集：以蛋白裂解液常规提取各组大鼠缺血半暗带脑组织蛋白，经匀浆离心后以聚氰基丙烯酸正丁酯(BCA)法测定各组蛋白浓度；②电泳：将收集的蛋白样品中加入5倍蛋白上样缓冲液，变性冷却后，采用10%十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶(SDS-PAGE)垂直电泳进行蛋白分离(100 V)；电泳后将凝胶上的蛋白条带电转移至聚偏氟乙烯(PVDF)膜上进行免疫反应(约80 min)；③转膜：使用Bio-Rad转膜装置，将凝胶上的蛋白条带电转移至PVDF膜上(300 mA，120 min)；④免疫反应：于室温下封闭1 h，经缓冲液洗膜后，加入一抗VEGF(1∶1 000)，4℃孵育过夜，次日经洗膜后加入二抗(1∶2 000)置室温下孵育1 h；⑤蛋白检测：化学发光剂(ECL)检测转印膜上靶蛋白信号，于暗室中曝光X线片，采用Alpha Ease FC图像分析软件对条带进行光密度(OD)分析，以目的条带与内参β-actin的比值表示目的蛋白表达水平。

1.8CD31免疫组化染色 取脑组织、固定、脱水、石蜡包埋，按5 μm厚度连续切片，免疫组化采用SP法。CD31/PECAM-1抗体(1∶250)，按试剂盒要求进行操作。参照文献〔10〕，采用Imagepro-plus6.0 软件分析免疫组化图片，先以30倍低倍镜找出大脑皮层缺血半暗带3个微血管密度(MVD)最高的区域(即热点区)，再换高倍镜(×400)计数被CD31染成阳性棕色的微血管数目，每个样本用5个400倍视野下的血管数目的平均值表示。

1.9统计学分析 采用SPSS18.0统计软件进行单因素方差分析。

2 结 果

2.1各组NSS比较 SO组未见神经功能缺损；其余各组在I/R后第7、14、28天均出现不同程度的神经功能缺损；各相同时间点相比，各移植组NSS显著低于MCAO组，其中以HP+QRHY组减少的最为明显(P<0.05)，见表1。

2.2各组神经细胞凋亡数比较 TUNEL法显示，各组神经细胞凋亡均于7 d达到高峰，至14、28 d逐渐下降。MCAO组7、14、28 d细胞凋亡数仍显著高于SO组(P<0.05或P<0.01)；与MCAO组比较，N-BMSCs、HP-BMSCs、BMSCs+QRHY、HP+QRHY组7、14、28 d细胞凋亡数显著减少(P<0.05)；与HP-BMSCs组比较，BMSCs+QRHY、HP+QRHY组7、14 d细胞凋亡数进一步减少，以HP+QRHY组减少更为明显(P<0.05)。见表2，图1。

表1 各组神经功能缺损评分比较分，n=6)

1)与SO组、2)与MCAO组、3)与N-BMSCs组、4)与HP-BMSCs组、5)与BMSCs+QRHY组比较:均P<0.05

表2 各组凋亡细胞计数比较个/视野,n=6)

与SO组比较:1)P<0.01，2)P<0.05；与MCAO比较:3)P<0.05；与HP-BMSCs组比较:4)P<0.01，5)P<0.05

2.3各组MVD计数比较 CD31免疫组化结果显示，各组缺血半暗带区MVD计数在7 d达到高峰，14、28 d有所回落。MCAO组7、14、28 d显著高于SO组(P<0.05)；HP-BMSCs、BMSCs+QRHY、HP+QRHY组显著高于N-BMSCs组(P<0.05)，HP+QRHY组显著高于HP-BMSCs组(P<0.05)。见表3，图2。

图1 7 d各组神经凋亡(×400)

表3 各组MVD计数比较个/mm2,n=6)

与SO组比较:1)P<0.05；与MCAO组比较:2)P<0.05；与N-BMSCs组比较:3)P<0.05；与HP-BMSCs组比较:4)P<0.05；同表4

图2 7 d各组CD31的表达(×400)

2.4各组VEGF蛋白表达比较 Western印迹显示，各组VEGF蛋白表达均于7 d达到高峰，至14、28 d表达逐渐下降，MCAO组7、14 d表达显著高于SO组(P<0.05)；与MCAO组比较，N-BMSCs、HP-BMSCs、BMSCs+QRHY、HP+QRHY组7、14、28 d VEGF蛋白表达显著增加(P<0.05)；与HP-BMSCs组比较，BMSCs+QRHY、HP+QRHY组蛋白表达进一步增加，以HP+QRHY组增加更为明显(P<0.05)。见表4，图3。

表4 各组VEGF蛋白表达比较值,n=6)

图3 各组VEGF蛋白表达电泳

3 讨 论

BMSCs移植在临床中的应用日益受到重视，然而在应用中也存在诸多问题，如何使其成为方便、高效的细胞制剂，是目前亟待解决的难题。近年来研究发现HP可能作为一种提高干细胞移植效果的方法而备受关注，其机制可能为激活内源性保护机制，如保护性蛋白的激活，从而提高细胞或机体的抗凋亡能力并刺激血管新生；而血管新生可改善脑组织血流、促进神经修复、清除坏死组织，成为治疗急性脑卒中的关键〔10，11〕。目前不少体外实验证实经HP处理的神经干细胞同样具有协同神经保护作用〔3，12〕。BMSCs移植可促进缺血损伤区的神经功能修复，可能机制是释放营养神经因子调动内源性修复机制，减少细胞坏死，促进神经和血管新生，如其能提高缺血半暗带VEGF表达水平，从而促进新生血管生成；或者直接分化成神经细胞并在缺血损伤部分再生出神经，其能促进神经功能的恢复已得到诸多研究所证实〔10～13〕。鉴于目前BMSCs的移植研究存在诸如诱导增殖、定向分化、安全性和疗效等问题，以基因修饰或用细胞因子和其他物质处理BMSCs移植又存在诸多不良反应。在血管新生的研究中，CD31又称为血小板内皮细胞黏附分子-1，是一种内皮细胞连接分子，主要表达于内皮细胞，是现在最常用的血管内皮细胞分化的标志之一，常用于MVD的测定〔13〕，免疫组化检测指标可作为机体血管生成的标志。VEGF又称为血管通透性因子，在血管生成的起始阶段起关键作用，通过丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)信号通路和磷脂酰肌醇-3激酶(PI3k)/蛋白激酶B(Akt)信号通路可以直接并特异地作用于血管内皮细胞，促进其分裂、增殖和迁移，促进脑梗死后新生血管和侧支循环形成，达到保护脑缺血损伤的作用〔14〕。

脑卒中的核心在于“脑络瘀阻”，其病机的核心是气血逆乱。气变于病之始，血变于病之成，“气不顺则为风”、“气有余便是火”，风火相合，上犯脑髓，窜入经络，血脉涩滞，凝而为痰，而成缺血性脑卒中。针对以上病机，本文提出“清热解毒，化瘀通络”的治法(简称清热化瘀法)，解毒以对抗损害因素是为祛邪，通络以畅行气血是为扶正，并在此基础上组建了清热化瘀方。前期临床研究表明本方是对脑梗死有确切疗效的中药复方制剂〔15〕，动物实验研究表明其可促进脑梗死后神经干细胞的增殖，提高干细胞的成活率，具有较好的神经保护作用〔6，7〕。本研究首次尝试以HP-BMSCs移植联合清热化瘀方来治疗急性脑梗死，体现了中医“治未病”的理念，这为中医药防治脑卒中提供了可供借鉴的思路和方法。

本实验结果表明，I/R损伤大鼠经移植BMCs后神经缺损症状减轻，细胞凋亡减少，MVD测定计数升高，VEGF蛋白表达上调，其可能机制是通过上调VEGF的表达从而提高MVD，从而产生神经保护作用。