清热解毒方药含药血清对脂多糖刺激下人单核细胞MAPK通路的干预作用

梅 雪 王豪勋 刘晓蕙 裴兰英

(河南中医药大学基础医学院，河南 郑州 450046)

肺泡巨噬细胞是参与肺部炎症的主要细胞。脂多糖(LPS)作为革兰阴性菌的菌体组成成分，是一种强烈的炎症启动因子，可引起细胞组织发生炎症反应、凋亡坏死等。清热解毒方药毒素清治疗细菌性肺炎疗效确切，前期开展动物体内试验，从免疫功能、细胞因子、信号通路等方面揭示该药治疗细菌性肺炎的机制〔1～3〕。本研究以LPS为刺激物，以单核细胞THP-1为研究对象，从重要炎症信号通路丝裂原活化蛋白激酶(MAPKs)通路入手，观察毒素清对LPS刺激下THP-1细胞内该通路的影响，为中药的临床应用提供依据。

1 材料与方法

1.1动物及材料 SD老龄大鼠60只(SPF级)，雌雄各半，平均体重(340±20)g，购于河南省实验动物中心，合格证号：SCXK〔豫〕2010-0002。细胞株人单核细胞系THP-1细胞株购于中国科学院上海生命科学研究院。毒素清颗粒(河南中医药大学第一附属医院院内制剂，批号为130727)，由人参、瓜蒌、白头翁等组成，每克含生药量1.66 g。 RPMI1640培养基(Solarbio公司)；胎牛血清(美国Life公司)；LPS(Sigma公司)；磷酸盐缓冲液(PBS)(Solarbio公司)。白细胞介素(IL)-1β、IL-6和IL-8酶联免疫吸附试验(ELISA)试剂盒(博士德生物有限公司)。Western印迹主要试剂：P38单克隆抗体、P-P38单克隆抗体(D3F9)、c-Jun氨基末端激酶(JNK)单克隆抗体(56G8)、P-JNK单克隆抗体(98F2)、细胞外调节蛋白激酶(ERK)单克隆抗体(137F5)、P-ERK单克隆抗体(D13.14.4E)、β-Tublin单克隆抗体(9F3)、GAPDH单克隆抗体(14C10)(Cell Signaling)；辣根过氧化物酶(HRP)标记的羊抗兔IgG(ZB2306，北京中杉金桥生物技术有限公司)。

1.2细胞的传代培养 单核细胞株THP-1接种于含10%胎牛血清，100 U/ml青霉素，100 U/ml链霉素，0.05 mmol/L β-巯基乙醇的RPMI1640完全培养基中培养，置于37℃，5% CO2培养箱中，每2～3天换液1次，约每3天按1∶3传代。

1.3含药血清制备 大鼠随机分为正常组、毒素清低浓度组、中浓度组、高浓度组，每组15只。每天分别给予等量生理盐水，低、中、高浓度毒素清(14、28、56 g/kg)灌胃(灌胃剂量=大鼠等效剂量×培养基内血清稀释度)，灌胃容积为10 ml/kg，2次/d，连续灌胃7次，末次给药1 h腹主动脉采血，灭活过滤，同组血清混合，-80℃保存备用。

1.4分组与干预 取对数生长期的THP-1细胞接种于96孔板，调整密度为1 × 108/L，同时加入50 ng/ml佛波酯(PMA)诱导48 h，以孔为单位，分为①空白组(含10%正常大鼠血清的培养液)；②模型组〔含10%正常大鼠血清的培养液+LPS(1 μg/ml)〕；③毒素清低浓度组(低浓度组)；④毒素清中浓度组(中浓度组)；⑤毒素清高浓度组(高浓度组)。③～⑤分别加入10%相应组别大鼠含药血清的培养液+LPS(1 μg/ml)。上述各组各设5个复孔，37℃，5%CO2培养24 h后，检测指标。

1.5ELISA检测细胞因子 收集细胞上清，严格按照试剂盒说明书，检测细胞因子IL-1、IL-6、IL-8。

1.6Western印迹检测MAPK通路蛋白 提取细胞总蛋白；聚氰基丙烯酸正丁酯(BCA)蛋白浓度测定试剂盒进行蛋白定量；配胶；以总蛋白含量为30 μg/孔按空白，模型，低、中、高浓度组的顺序加样，进行十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶(SDS-PAGE)电泳后转膜，室温封闭液中振摇封闭2 h；加一抗4 ℃孵育过夜，Tween-20 Tris-盐酸缓冲液(TBST)洗膜，与二抗37 ℃孵育1 h，TBST漂洗；电化学发光(ECL)显色，曝光照相；结果用凝胶成像分析软件分析，采用磷酸化蛋白与总蛋白的灰度值比值进行统计分析。

1.7统计学处理 采用SPSS18.0软件进行One-Way ANOVA检验，方差齐者采用LSD法，方差不齐者采用DunnettT3法。

2 结 果

2.1毒素清含药血清对THP-1细胞分泌IL-1β、IL-6、IL-8的影响 与空白组相比，模型组IL-1β、IL-6、IL-8的表达均显著升高差异有统计学意义(P<0.01)；3个不同浓度的含药血清组IL-1β、IL-6表达较模型组均显著降低差异有统计学意义(P<0.01，P<0.05)，中高浓度组IL-8表达显著减少差异有统计学意义(P<0.01)。与低浓度组相比，中高浓度组IL-1β、IL-6、IL-8的表达均显著降低差异有统计学意义(P<0.05)。见表1。

表1 各组细胞IL-1β、IL-6、IL-8、P-P38MAPK、P-JNK、P-ERK的表达比较

与空白组比较：1)P<0.01；与模型组比较：2)P<0.05，3)P<0.01;与低浓度组比较：4)P<0.05

2.2毒素清含药血清对THP-1细胞P-P38MAPK、P-JNK46/54、P-ERK42/44表达的影响 模型组细胞P-P38MAPK、P-JNK、P-ERK表达较空白组均显著升高(P<0.01)；低、中、高浓度组P-P38MAPK、P-ERK的表达较模型组均显著降低(P<0.01，P<0.05)，其中，中高浓度组表达显著低于低浓度组(P<0.05)；中高浓度组P-JNK表达较模型组和低浓度组均显著降低(P<0.01，P<0.05)。见表1，图1。

A：空白组；B：模型组；C：低浓度组；D：中浓度组；E：高浓度组图1 各组细胞P-P38MAPK、P-JNK46/54、P-ERK42/44蛋白的表达

3 讨 论

细菌性肺炎是临床常见的肺部感染，具有较高的发病率和死亡率。中医药治疗肺炎已取得了满意成效，并在减少细菌耐药性产生和降低抗生素的不良反应等方面也具有明显优势。前期从炎症通路层面开展的大鼠实验表明：毒素清能够改善肺损伤，与其干预核因子(NF)-κB信号通路，减少炎症因子分泌有关〔3〕。巨噬细胞是参与炎症反应的重要细胞。

MAPK通路是参与炎症反应的主要通路之一，包括分别由P38MAPK、JNK、ERK1/2介导的三条级联反应。LPS作为感染刺激物，作用于单核巨噬细胞、内皮细胞等细胞表面受体Toll样受体(TLR)，激活MAPK和NF-κB信号通路，诱导多种炎症因子如IL-1β、IL-6、IL-8等的合成和释放，介导炎症的发生发展〔4,5〕。适度的炎症反应对机体是保护性的，但如果炎症因子过度释放，则会引起炎症损伤，抑制炎症通路可减少炎症因子的释放，从而改善炎症损伤〔6～8〕。在体内外实验中，一种新合成的黄酮LFG-500能够通过抑制MAPK和NF-κB信号通路减少炎症因子的分泌，从而减轻急性肺损伤和炎症反应〔9〕。芹黄素可能成为新的炎症性疾病治疗药物，其作用机制与其通过激活过氧化物酶体增殖物激活受体(PPAR)-γ，减少TLR4的表达，抑制TLR4介导的MAPK和NF-κB信号通路，减少炎症因子的分泌有关〔10〕。本实验提示，毒素清能够减少P38MAPK、JNK、ERK蛋白的磷酸化，其作用同样呈现一定的浓度依赖性，以中高浓度作用显著。

综上，LPS作为感染刺激物作用于单核巨噬细胞，激活了该细胞内MAPK信号通路，促进了炎症因子的分泌。清热解毒方药毒素清减轻肺部炎症损伤的机制与其抑制单核巨噬细胞内MAPK通路的活化，降低炎症细胞因子的表达有关。