九龙虫对慢性支气管炎大鼠血浆及肺组织SP和VIP的影响

潘朝旺 杨家林 周先云 王 伟 万进军 祁学章

(鄂州职业大学医学院，湖北 鄂州 436000)

慢性支气管炎是气管、支气管黏膜及其周围组织的慢性非特异性炎症，其发病机制尚不完全清楚，目前认为是多种因素共同作用的结果〔1〕。临床上以咳嗽、咳痰及喘息为主要表现，且受生活习惯及气候环境影响，该病严重时可发展为肺源性心脏病，因此发现和寻找对慢性支气管炎疗效好、安全性高的药物具有重要的经济和社会意义。本实验拟通过观察九龙虫对慢性支气管炎模型大鼠体重、支气管肺泡灌洗液白细胞计数、分类及血浆和肺组织P物质(SP)、血管活性肠肽(VIP)的影响，探讨其抗慢性支气管炎的作用及机制。

1 材料与方法

1.1动物 Wistar雄性大鼠60只，体重(200±20)g，SPF级，由湖南中医药大学实验动物研究中心提供，动物合格证号：SYXK(湘)2013-0005。

1.2药物与试剂 九龙虫散，本院自制，用前配成混悬液；大鼠SP(20160715)、VIP酶联免疫吸附试验(ELISA)试剂盒(20160806)，深圳子科生物科技有限公司；桂龙咳喘宁胶囊，桂龙药业(安徽)有限公司，批号：20160106。

1.3仪器 μs-2200全自动五分类血液细胞分析仪，深圳市库贝尔生物科技股份有限公司；台式冷冻离心机，上海安亭科学仪器公司；PT-MR3100D组织匀浆机，瑞士Polytron公司；9602A酶标仪，南京普朗医用设备有限公司；UV754紫外可见分光光度计，上海佑科仪器仪表有限公司；NE-C28 欧姆龙压缩式吸入器，欧姆龙(大连)有限公司；超声波细胞粉碎机，上海豫明仪器有限公司。

1.4动物造模及分组给药 将大鼠适应性喂养1 w，按体重随机分为正常组、模型组、阳性对照组、九龙虫高、中、低剂量组，除正常组外，在参照文献〔2〕的基础上进行改进，建立脂多糖雾化慢性支气管炎大鼠模型：第1天将大鼠麻醉(1%戊巴比妥钠，剂量50 mg/kg)，固定，暴露声门，用静脉导管针套管向气管内快速注入1 mg/ml脂多糖溶液200 μl(正常组将0.1%脂多糖换成生理盐水进行同样操作)；从第2天开始，将大鼠分置在自制的50 cm×60 cm×40 cm的玻璃箱中，雾化吸入50 μg/ml脂多糖溶液(正常组将50 μg/ml脂多糖换成生理盐水进行同样操作)，每次1 h，每天1次，连续28 d。从第1天开始，正常组及模型组给予生理盐水15 ml·kg-1·d-1，阳性对照组给予桂龙咳喘宁胶囊混悬液0.75 g·kg-1·d-1，九龙虫高、中、低剂量组分别给予九龙虫混悬液0.04、0.02、0.01 g·kg-1·d-1，连续给药35 d，称重。

1.5一般情况 观察并记录大鼠活动状态、毛发光泽度、进食饮水及死亡数量，记录造模前及最后一次给药后的体重变化。

1.6支气管肺泡灌洗液白细胞计数及分类 将大鼠取血后(血液另作他用)处死，参照文献〔3〕，暴露气管及肺部，反复灌洗左肺3次，方法：结扎右主支气管，用注射器抽取生理盐水2 ml，从隆突上穿刺至左肺，冲洗，回收灌洗液共约4.5 ml。用全自动五分类血液细胞分析仪检测灌洗液白细胞总数、巨噬细胞、中性粒细胞及淋巴细胞计数。

1.7血清SP、VIP测定 末次给药24 h后，将大鼠用1%戊巴比妥钠麻醉，腹主动脉取血约5 ml，4 000 r/min离心10 min，制备血清，严格按试剂盒说明采用ELISA法测定SP、VIP含量。

1.8肺组织SP、VIP测定 取大鼠右肺中叶肺组织约1.0 g，冷生理盐水漂洗，滤纸吸湿，称重，剪碎，加入9倍冷生理盐水，用组织匀浆机匀浆10 min后再用超声波细胞粉碎机粉碎10 min，4 000 r/min离心10 min，严格按试剂盒说明采用ELISA法测定SP、VIP含量。

1.9统计学处理 采用SPSS19.0软件进行单因素方差分析、t检验。

2 结 果

2.1各组大鼠一般情况比较 造模后，模型组大鼠出现活动减少，倦怠，皮毛枯燥松弛并逐渐失去光泽，还出现咳嗽及喘息等，阳性对照组和九龙虫各剂量组上述情况明显改善；与正常组比较，模型组大鼠给药后体重及体重增加量明显减少(P<0.01)，而各给药组体重及增加量明显高于模型组，差异有统计学意义(P<0.05，P<0.01)，见表1。

2.2各组支气管肺泡灌洗液白细胞计数及分类比较 与正常组比较，模型组白细胞总数、中性粒细胞百分比升高，而巨噬细胞百分比降低，差异有统计学意义(P<0.01)，但淋巴细胞百分比比较差异无统计学意义(P>0.05)。各给药组与模型组比较，白细胞总数、中性粒细胞百分比降低，巨噬细胞百分比升高，差异有统计学意义(P<0.05，P<0.01)；但淋巴细胞百分比比较，差异无统计学意义(P>0.05)，见表2。

2.3各组血清、肺组织SP、VIP比较 模型组血清、肺组织SP水平明显高于正常组，VIP水平明显低于正常组(P<0.01)。各给药组血清、肺组织SP水平明显低于模型组，而VIP水平明显高于模型组(P<0.05或P<0.01)。与正常组比较，九龙虫低剂量组血清、肺组织SP水平显著升高，VIP水平显著降低(P<0.05)，见表3。

表1 各组大鼠体重比较

与模型组比较：1)P<0.05，2)P<0.01；同表2

表2 各组支气管肺泡灌洗液白细胞计数及分类比较

表3 各组血清、肺组织SP、VIP比较

与模型组比较：1)P<0.05，2)P<0.01；与正常组比较：3)P<0.05

3 讨 论

慢性支气管炎作为呼吸系统的一种常见病，特别是老年人由于身体功能下降，发病率较高，危害较大〔4，5〕。神经肽作为存在于神经组织并参与神经系统功能作用的内源性活性物质，在体内调节多种多样的生理功能，具有含量低、活性高、作用广泛而又复杂的特点。神经肽既存在于神经组织，同时也在肠、肺、脑等外周器官和组织广泛分布。

SP是一种含有11个氨基酸的由非肾上腺能非胆碱能兴奋性神经释放的神经肽，广泛分布于细神经纤维内，在中枢神经末梢释放的SP与痛觉传递有关，而外周神经末稍释放SP，在支气管和肺组织中分布广泛，可与肺血管平滑肌上SP受体特异性结合发挥生理效能，其受体NK-1R在肺间质细胞、肺泡上皮细胞、血管内皮细胞、各种炎症细胞、免疫细胞表面均有表达。在生理浓度下，SP可舒张肺血管，增加血流量及增强血管通透性，但是在高浓度下，SP则使舒张的肺血管发生收缩效应。SP还具有促炎症作用，与T淋巴细胞增殖、B淋巴细胞产生抗体及单核巨噬细胞与肥大细胞释放炎症介质、多形核白细胞呼吸爆发等功能有关〔6〕，导致炎症细胞在气道周围浸润，气道平滑肌收缩，黏液分泌增加，血管扩张、通透性增加等。研究发现，SP水平升高可引起气道平滑肌收缩，气道黏膜腺体分泌增强，导致炎性浸润反应〔7〕。另外研究表明，SP与慢性阻塞性肺疾病、哮喘的气道高反应性和气道炎症的形成有密切关系〔8〕。慢性支气管炎由于气道炎症，导致气道上皮损伤甚至脱落，前列腺素等炎症因子可刺激裸露的神经末梢，引起SP释放；由于气道上皮损伤或脱落，使降解SP的内肽酶减少，导致SP升高。本实验提示九龙虫对慢性支气管炎有治疗作用。

VIP是由含170个氨基酸的前血管活性肠肽原经酶解而成的二十八肽的一种神经递质，是非肾上腺能非胆碱能抑制性神经的神经递质之一，在神经细胞内合成后经局部神经纤维末梢释放，释放VIP的神经纤维在人体广泛分布，参与机体消化系统、内分泌系统、中枢神经系统、呼吸道、心血管等的功能调节，还对炎症介质的释放具有较强的抑制作用，此外，还参与免疫反应的调节。VIP在胃肠道中含量最高，参与松弛胃肠平滑肌，促进腺体分泌等作用〔9〕。VIP是已知的肺组织最丰富的神经多肽之一，在呼吸系统气道平滑肌、黏膜下腺体、血管壁和肺组织的胆碱能神经节前纤维及神经节细胞，广泛存在VIP能神经纤维，VIP受体在肺血管平滑肌、大气道平滑肌、气道上皮和黏膜下腺体内具有高密度分布〔10〕。VIP具有强大的抗炎作用，抑制嗜酸性粒细胞的释放和黏附，并对抗白三烯、内皮素、组胺等引起的支气管平滑肌收缩作用。当呼吸系统受到刺激时，VIP和乙酰胆碱都释放增加，乙酰胆碱使气道收缩及血管通透性增加，而VIP可以减弱乙酰胆碱的上述作用，还参与机体免疫反应调节，抑制炎症介质的释放；当体内 VIP含量减少时，机体抗炎作用减弱，炎症介质释放增加，支气管收缩作用增强，血管通透性增加，加重慢性支气管炎症状。本实验提示九龙虫对慢性支气管炎有治疗作用，可降低慢性支气管炎模型大鼠SP水平，增加VIP水平，为其用于慢性支气管炎的治疗提供了实验依据。