芪芍复脉汤对大鼠下肢缺血模型MVD及VEGF蛋白表达的影响

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近年来，以动脉硬化闭塞症、血栓闭塞性脉管炎和糖尿病足为主的下肢缺血性疾病严重困扰着人们的健康，由组织代谢量与维持生命活动的氧气需求量之间不平衡所导致。血管新生技术的出现，为建立有效的侧支循环，改善下肢缺血状态开辟了新途径。中医药凭其多途径、多靶点的优势，治疗下肢缺血性疾病前景广阔。本实验采用结扎大鼠下肢股动脉制造下肢缺血模型，探讨芪芍复脉汤对促进缺血下肢血管新生的作用及其机制，以期为芪芍复脉汤的临床应用提供实验依据。

1 材料与方法

1.1 大鼠下肢缺血模型的建立 SD大鼠108只，雄性，6月龄，体质量250 g～300 g，购自中国人民解放军军事医学科学院实验动物中心，合格证号：SCXK(军)2014-0004。常规饲养1周后，随机分为模型组(90只)和假手术组(18只)。大鼠腹腔注射3.5%水合氯醛(1 mL/100 g)麻醉，选左侧腹股沟中点向膝部作一长度约2 cm的纵向切口，紧贴腹股沟下方分离股动脉主干，行股动脉结扎、离断及分支剔除术，制造下肢缺血模型。假手术组仅暴露股三角，不结扎动脉及其分支，术后大鼠下肢肌肉注射抗青霉素(8 U)，连续3

d，预防感染。

1.2 动物分组 将造模成功的大鼠，按随机数字表法分为5组，模型组18只，芪芍复脉汤高剂量组18只，中剂量组18只，低剂量组18只，粒细胞集落刺激因子(rhG-CSF)组18只。

1.3 给药方法 芪芍复脉汤组方：黄芪30 g，当归15 g，桂枝15 g，麦冬10 g，赤芍15 g，川芎10 g，三七3 g，丹参30 g，土元6 g，全蝎6 g，川牛膝30 g，甘草6 g。广东一方制药有限公司生产颗粒剂，1 g颗粒折合生药量4.5 g ，根据药物的溶解性确定最大给药浓度，以此作为高剂量给药浓度，0.50倍为中剂量给药浓度，0.25倍为低剂量给药浓度。给药剂量为：高剂量组7.6 g/(kg·d)，相当于60 kg体重成人用量的12倍；中剂量组3.8 g/(kg·d)，相当于60 kg体重成人用量的6倍；低剂量组1.9 g/(kg·d)，相当于60 kg体重成人用量的3倍，加温开水至10 mL，1 mL/100 g；模型组和假手术组灌服蒸馏水，1 m L/100 g，每天1次，连续14 d。

阳性对照药：应用rhG-CSF 200 μg /1.2 mL， 购自山东齐鲁制药有限公司，批号S19990049。用生理盐水稀释至12 mL 备用，予rhG-CSF组大鼠患肢皮下注射，注射量0.21 mL/100 g，相当于60 kg体重成人用量的7倍， 每日1次，连续5 d。

1.4 主要试剂与仪器 一抗(VEGF)购自英国abcam公司，货号：ab52917；二抗(HRP山羊抗兔鼠通用)购自丹麦DAKO公司，货号：K5007；CD34抗体，购自英国abcam公司，批号：ab8158 ；组化试剂盒DAB显色剂购自丹麦DAKO公司，货号：K5007。

1.5 检测指标 术后3 d、7 d、14 d，各组取6只大鼠，用免疫组化方法检测大鼠患侧内收肌毛细血管密度(MVD)和血管内皮生长因子(VEGF)蛋白表达。

1.5.1 缺血骨骼肌中毛细血管密度测定 石蜡包埋，切片后脱蜡，EDTA抗原修复缓冲液修复抗原，待自然冷却后，用3%过氧化氢溶液温室避光孵育25 min，用3%BSA均匀覆盖组织，室温封闭30 min，滴加一抗，4 ℃孵育过夜， PBS 缓冲液洗涤 5 min共3次，滴加二抗体，室温37 ℃孵育20 min，PBS 缓冲液洗涤5 min共3次，DAB显色，复染、封片。进行400倍的显微照相。

1.5.2 缺血骨骼肌VEGF蛋白表达测定 石蜡包埋、切片后脱蜡，EDTA抗原修复缓冲液修复抗原，自然冷却后，用3%过氧化氢溶液温室避光孵育25 min，用3%BSA均匀覆盖组织，室温封闭30 min，加一抗VEGF后4℃孵育过夜， PBS 缓冲液洗涤5 min共3次，滴加二抗(HRP山羊抗兔鼠通用)，室温孵育50 min，再用PBS 缓冲液洗涤 5 min共3次，滴加DAB显色液，显微镜下观察2 min，冲洗切片终止显色，复染细胞核，脱水，封片。400倍显微镜镜检，每张切片选择 6个视野，应用图像采集分析系统计算光密度值，取均值作为VEGF的蛋白表达量。

1.6 统计学处理 采用SPSS 21.0统计软件处理，不同处理因素不同时间点各指标比较采用析因设计资料的方差分析，如果存在交互作用，分析各因素的单独效应；如果无交互作用，则分析各因素的主效应。LSD法进行组间比较。

2 结 果

2.1 大鼠下肢缺血模型建立情况 结扎、离断大鼠下肢股动脉及其分支的造模效果显著，除假手术组外，其余各组均有不同程度的活动障碍，6组大鼠下肢未见坏死。

2.2 各组MVD值比较 术后3 d，各组间MVD值无统计学意义；术后7 d，各组间总体不全相同，rhG-CSF组、芪芍复脉汤高剂量组、芪芍复脉汤中剂量组较模型组与低剂量组比较上升(P<0.05或P<0.01)，rhG-CSF组与高剂量组比较有统计学意义(P<0.05)；术后14 d，各组间总体不全相同，rhG-CSF组、芪芍复脉汤高剂量组较模型组和低剂量组差异有统计学意义(P<0.01)，中剂量组较模型组升高(P<0.05)，并且高剂量组高于中剂量组(P<0.05)，高剂量组与G-CSF组比较差异无统计学意义。详见表1、图1。

表1 各组大鼠不同时间点MVD值比较(±s)

图1 各组MVD免疫组化图

2.3 各组VEGF蛋白表达比较 假手术组术后各时间点之间比较无统计学意义；术后3 d，芪芍复脉汤高、中剂量组、G-CSF组VEGF光密度值较模型组升高(P<0.01)，高剂量组较低剂量组升高(P<0.01)，中剂量组较低剂量组升高显著(P<0.05)；术后7 d，模型组较假手术组VEGF光密度值升高(P<0.05)，芪芍复脉汤高、中剂量组和G-CSF组较模型组升高(P<0.01)，其中G-CSF组较高剂量组升高(P<0.05)，高剂量组较低剂量组升高显著(P<0.05)；术后14 d，高、中剂量组和G-CSF组较模型组升高显著(P<0.05或P<0.01)，并且高剂量组高于中剂量组(P<0.05)，中剂量组高于低剂量组(P<0.05)。详见表2、图2。

表2 各组大鼠不同时间VEGF蛋白表达(±s)

3 讨 论

血管内皮细胞生长因子是血管内皮细胞特异性的肝素结合蛋白，由不同长度、形态和酸碱度的氨基酸构成。在血管生成和侧支循环构建过程中，依赖相关生长因子，发挥调控作用。研究表明VEGF可特异性促进血管内皮细胞有丝分裂[1]，有强烈的促血管生成作用。其起作用的方式主要有3方面[2-4]：①它可以直接作用于血管内皮细胞，特异性地与血管内皮上的特殊受体相结合，促进内皮细胞的分裂、增殖，从而促进血管新生；②通过招募骨髓中的内皮祖细胞(EPCs)向外周血迁移、归巢、整合于受损血管丛，进而分化为内皮细胞，促进血管新生。Takah等[5]给予缺血大鼠外源性的VEGF，从而升高外周血中 EPCs 的数量，就是利用VEGF的这一作用促进了血管再生。③VEGF具有高通透性，因此也叫血管渗透因子[3]，它可以通过增加微血管的通透性，使血液内的血浆蛋白渗透致血管外，大量的纤维蛋白原凝固成纤维蛋白，作为内皮细胞、成纤维细胞等暂时的基质成分，并促进血管内皮细胞的分裂、增殖，最终促进血管的生成。毛细血管密度是检测血管新生的重要指标[6]，它反映血管再生能力的强弱，即MVD的值越高，代表新生毛细血管越丰富。

本研究结果发现：术后14 d，芪芍复脉汤高、中剂量组增加了缺血骨骼肌局部毛细血管密度，并且显著高于模型组，意味着芪芍复脉汤能够促进下肢缺血大鼠模型的血管新生。实验中芪芍复脉汤高、中剂量组与模型组和假手术组相比，VEGF 的光密度值显著上调，证明芪芍复脉汤能通过上调促血管新生因子蛋白的表达，提高缺血下肢微血管密度，促进缺血下肢侧支循环的形成，促进血管新生。

大量的实验研究证实，中药相对西药具有多靶点、多途径的治疗优势，很多中药具有促血管新生的作用[7]。血管新生是近年提出的概念，然而早在几千年前中医学中就有记载：“夫脉者，血之府也。”《灵枢·经水》载：“若夫八尺之士，皮肉在此，外可度量切循而得之，其死可解剖而视之……脉之长短……皆有大数”。说明中医所述的“脉”和现代医学的“血管”名异而实同，无论从形态结构还是功能上都相对应。从古至今，大部分医家认为下肢缺血性疾病的基本病机为气血瘀滞，经络阻塞，阳气不能达于四末。在下肢缺血性疾病的治疗上把活血化瘀方法贯穿始终，然而形成瘀血的病因方面历代医家却众说纷纭。吾师李廷荃教授认为，下肢缺血性疾病的发病以中老年人为主，年过半百，其天葵衰，正气亏虚，所以气血亏虚是导致疾病发生的主要原因。现代研究证明阴虚病人的血液黏稠度、红细胞沉降率、纤维蛋白原含量均高于正常人[8]。阴虚可以导致血液运行迟缓，形成瘀血，所以阴虚是缺血性疾病发病的重要因素。吾师认为治疗此病，当以益气活血、滋阴复脉为治疗大法。

芪芍复脉汤是李廷荃教授经过多年临床实践，反复探索与完善总结出的治疗下肢缺血性疾病的效验方。方中黄芪补气，培正固本，使气旺则血行；赤芍活血散瘀；麦冬养阴增液，使阴血充、脉络盈；三药共为君，奏益气活血、滋阴复脉之功。桂枝助阳化气，温通经脉，发越阳气，温养肌肤；三七、川芎、丹参、川牛膝活血祛瘀、行气止痛，助赤芍活血化瘀，与桂枝共为臣；当归养血补血，助麦冬养阴增液；土元、全蝎借其行散走窜之力，搜风通络止痛与当归共为佐药。甘草调和诸药，解土元、全蝎之毒性，为使。全方养阴血以增津液，活血化瘀以通脉络，使正气壮，瘀血除，新血生，血供改善，从而减轻肢体不适症状。

本实验得出：芪芍复脉汤不同剂量组与模型组比较均有差异，并且术后14 d高剂量组VEGF光密度值和MVD值均显著高于中剂量组和低剂量组，中剂量组显著高于低剂量组，说明芪芍复脉汤对下肢缺血大鼠模型的治疗存在剂量依赖性，为临床治疗下肢缺血性疾病提供了剂量指导和实验依据。

芪芍复脉汤能够促进缺血大鼠下肢骨骼肌毛细血管密度的增多，促进血管新生，其机制可能与促进缺血组织VEGF蛋白表达有关。芪芍复脉汤能否动员骨髓中的EPCs，能否增加缺血组织中CD34阳性细胞的含量，还有待进一步的实验观察。