一种肉桂水提物抗单纯疱疹病毒1型活性研究

2018-11-14任超黄茜王萍李莹杨兆祥张建文

中华实验和临床病毒学杂志 2018年5期

任超黄茜王萍李莹杨兆祥张建文

650100昆明,昆药集团股份有限公司

单纯疱疹病毒(herpes simplex virus，HSV)是一种双链DNA包膜病毒，根据血清型不同可分为Ⅰ型和Ⅱ型(HSV-1和HSV-2)。世界卫生组织(WHO)报道，全球约90%的人口感染过疱疹病毒，最常见的是HSV-1，可以潜伏感染，亦可被激活引起皮肤疱疹或生殖器疱疹、结膜炎、角膜炎、脑炎或疱疹性湿疹等[1]。

目前没有可用于防治HSV感染的疫苗，临床常用的治疗药物是以阿昔洛韦(acyclovir，ACV)为代表的核苷类似物。但是，大多数核苷类药物都有靶点单一、生物利用度低、半衰期短和副作用严重的缺陷，且长期使用会产生耐药[2]。因此，寻找新作用机理、毒副性小的抗HSV药物有实际临床需求。随着对天然产物药物研究的不断深入，大量天然产物单体、活性部位或复方被报道具有抗HSV方面的药理作用，如夏枯草多糖、黄芪总皂苷、青蒿缩合鞣质(CTA)、蓝花荆芥提取物等[3]。肉桂(Cinnamomum cassia)是我国常用中药材。本研究以Vero细胞和HSV-1(角膜)感染动物模型研究了肉桂水提物KPC-rg1对HSV-1的抗病毒作用；进一步的，通过体外抗病毒活性实验探索了KPC-rg1对9种病毒的潜在广谱抗病毒作用。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 病毒:本研究测试的病毒见表1。

1.1.2 细胞株:Hep-2(ATCC CCL-23)，RD(Cell bank of CAS-TCHU 45)，Vero E6(ATCC CRL-1586)，Vero(中科院昆明动物所)，H1 HeLa(ATCC CRL-1958)， MRC5(ATCC CCL-171)，MT-4(NIH AIDS项目)。

1.1.3 实验动物:雌性BALB/c小鼠与雌性6月龄树鼩，购自昆明医科大学实验动物中心。

1.1.4 药材与药物:肉桂购自昆明市官渡区滇芝堂，经鉴定为樟科植物肉桂(Cinnamomum cassia Presl)的干燥树皮。阿昔洛韦(批号:20160811，纯度:99.82%，湖北科益药业股份有限公司)。

1.1.5 试剂与仪器:CCK8试剂盒(天津百萤)；CellTiter-Glo试剂盒(Promega)；小牛血清(GIBCO)；DMEM(Thermo Scientific)；SpectraMax340PC384 型酶标仪(Molecular Device)；UB-7型pH(丹佛仪器有限公司)；Synergy/HT(BioTek)；Acumen eX3 高内涵成像仪(TTP Labtech)；天平(METTLER TOLEDO MS)；离心机(Sorvall biofuge stratos)；XD—202型光学显微镜(江南光学仪器厂)；CO2培养箱(Thermo)。

1.2 方法

1.2.1 肉桂水提物KPC-rg1的制备:取肉桂树皮粉碎，过24目筛，称取200 g，20℃浸泡提取2 h/次，共3次，合并滤液，浓缩至1 000 ml，加入KCl定容至终浓度0.5 mol/L，用HCl调pH 至4，静置24 h，取沉淀部分减压干燥即得KPC-rg1。

1.2.2 KPC-rg1细胞毒性实验:Vero细胞铺板，37℃，5%CO2培养过夜，设实验组、对照组、空白组，48 h后读取OD值并计算细胞存活率。

1.2.3 KPC-rg1体外抗HSV-1病毒活性检测:Vero细胞铺板培养过夜，将 HSV-1悬液(MOI=5)或HSV-1与不同浓度KPC-rg1混合液滴定于细胞中吸附1.5 h，弃上清并洗3次，前者加入含不同浓度KPC-rg1的细胞维持液，后者仅加细胞维持液继续培养。48 h后显微镜下观察细胞形态，并计算病毒悬液的TCID50值。

1.2.4 KPC-rg1在HSV-1角膜感染模型中的药效评价

1.2.4.1 小鼠角膜感染模型:72只小鼠，眼角膜给予空针划伤后向结膜囊内分别滴人PBS、5μl病毒悬液(滴度为1.0×104PFU/眼)或药物+病毒悬液。1.2.4.2 树鼩角膜感染模型:48只树鼩，100 mg/kg的Ketamine麻醉后，对树鼩进行眼膜划痕后将HSV-1病毒滴加于眼膜上(滴度为1.0×106PFU/眼)。

1.2.4.3 实验分组如下:①空白组②模型组③KPC-rg1组④HSV-1+KPC-rg1孵育组⑤ACV组⑥HSV-1+ACV孵育组。依据正常动物眼角膜药物耐受预实验数据，小鼠模型③-⑥组均设置3个药物浓度梯度(即0.2 μg/眼、1 μg/眼、4 μg/眼)，而树鼩模型设2个浓度梯度(0.2μg/眼和4μg/眼)，每个浓度4只动物。

1.2.4.4 角膜炎分级或症状判断参照Trousdale标准[4-5]。

1.2.5 KPC-rg1广谱抗病毒活性筛选(由上海药明康德新药开发有限公司完成):除HCMV采用荧光衰减实验测定，其他8株病毒采用细胞病变效应(cytopathic effect，CPE)实验测定。KPC-rg1的细胞毒性实验与抗病毒活性筛选实验平行进行，除了没有病毒感染外，其他的实验条件与抗病毒实验一致。

图1 KPC-rg1对Vero细胞增殖的抑制作用Fig.1 Inhibition of Vero cell proliferation by KPC-rg1

图2 KPC-rg1或ACV给予被HSV-1感染细胞(A)和KPC-rg1或ACV与HSV-1共孵育后感染细胞(B)的病毒载量Fig.2 Viral load of HSV-1 infected cells after KPC-rg1 or ACV treated(A)and cells infected by HSV-1 co-incubated with KPC-rg1(B)

2 结果

2.1 KPC-rg1的细胞毒性如图1所示，当KPC-rg1的浓度小于0.1 mg/ml时，对细胞生长基本无毒性，该剂量为进行HSV-1体外抗病毒活性检测提供了依据。

2.2 KPC-rg1对HSV-1的体外抗病毒活性显微镜下，Vero细胞被HSV-1感染后呈现典型的细胞皱缩、变圆、碎裂等细胞病变现象。若被感染细胞分别加入 0.0001、0.001、0.01 mg/ml KPC-rg1 或 ACV，病毒载量下降2.2 vs 2.4倍、5.3 vs 5.6倍、6.5 vs 1335倍，呈剂量依赖性对细胞有保护作用(图2)。

若HSV-1与KPC-rg1或ACV共孵育后再感染细胞，0.001～0.1 mg/ml KPC-rg1对细胞有明显保护作用，其中0.001 mg/ml和0.01 mg/ml KPC-rg1分别使病毒载量下降5.6和238倍，而ACV在相同浓度下对细胞保护作用较KPC-rg1弱(图2)。

2.3 KPC-rg1抗HSV-1体内药效评价

2.3.1 小鼠角膜感染模型:正常小鼠眼角膜药物耐受预实验提示KPC-rg1浓度高于5μg/眼时出现严重刺激作用，故该实验设置给药组为0.2μg/眼、1 μg/眼与4 μg/眼。

结果显示:对照组HSV-1感染后第3天眼睛出现炎症、水肿、伴有分泌物和糜面的发生。感染后第2天开始给药，持续7 d，KPC-rg1未能改善角膜病变情况；HSV-1与KPC-rg1共孵育后能有效保护角膜，未观察到病变。按角膜炎分级判断标准，各组角膜病变评分统计见表2。

2.3.2 树鼩HSV-1+角膜感染模型:在树鼩角膜接种HSV-1后第9、12、19天检查角膜病变并记录评分(表3)。KPC-rg1对角膜病变的改善均不明显，而HSV-1与KPC-rg1共孵育后能有效保护角膜，病变较轻微。

2.4 KPC-rg1广谱抗病毒活性筛选 KPC-rg1对HIV-1、HCMV、RSV Along和 HSV-1 的 EC50分别为9.24 μg/ml， 42.55 μg/ml， 40.66 μg/ml和 32.74 μg/ml，具有明显抗病毒活性，而对其他5株病毒没有表现出抗病毒活性(表4)。

表2 测试病毒感染小鼠角膜病变比较(¯±s)Tab.2 Comparison of corneal lesions in each group of mouse infected by tested viruses(¯±s)

组别造模前 4 d 6 d 8 d空白组 n=12 0±0 0±0 0±0 0±0模型组 n=12 0±0 2.25±0.45 3.5±0.43 3.79±0.33 KPC-rg1组(0.2μg/眼)，n=4 0±0 0.75±0.29 1.88±0.25 3.00±0.41 KPC-rg1组(1μg/眼)，n=4 0±0 1.00±0.41 2.25±0.65 3.25±0.29 KPC-rg1组(4μg/眼)，n=4 0±0 1.25±0.29 2.88±0.48 3.375±0.25 HSV-1+KPC-rg1孵育组(0.2μg/眼)，n=4 0±0 0 ±0 0±0 0±0 HSV-1+KPC-rg1孵育组(1μg/眼)，n=4 0±0 0±0 0±0 0±0 HSV-1+KPC-rg1孵育组(4μg/眼)，n=4 0±0 0±0 0±0 0±0 ACV组(0.2μg/眼)，n=4 0 ±0 0.625±0.25 0.875±0.25 1.00±0 ACV组(1μg/眼)，n=4 0±0 0.625±0.25 1.625±0.49 2.625±0.25 ACV组(4μg/眼)，n=4 0±0 1.00±0.41 3.00±0.41 3.875±0.25 HSV-1+ACV孵育组(0.2μg/眼)，n=4 0±0 0.50±0 1.00±0.41 1.125±0.25 HSV-1+ACV孵育组(1μg/眼)，n=4 0±0 0.625±0.25 2.375±0.25 3.125±0.25 HSV-1+ACV孵育组(4μg/眼)，n=4 0±0 0.50±0 3.625±0.25 3.75±0.29

表3 测试病毒感染树鼩角膜症状比较(¯±s)Tab.3 Comparison of corneal lesions in each group of tree shrews infected by tested viruses(¯±s)

组别造模前 9 d 12 d 19 d空白组n=8 0±0 0±0 0±0 0±0模型组n=8 0±0 2.25±0.46 3.375±0.52 0.5±0.53 KPC-rg1组(0.2μg/眼)，n=4 0±0 1.75±0.5 1.5±0.58 0.25±0.5 KPC-rg1组(4μg/眼)，n=4 0±0 1.5±0.58 2.00±0.82 0.5±0.58 HSV-1+KPC-rg1孵育组(0.2μg/眼)，n=4 0±0 0.5±0.57 0.5±0.57 0±0 HSV-1+KPC-rg1孵育组(4μg/眼)，n=4 0±0 0±0 0±0 0±0 ACV组(0.2μg/眼)，n=4 0±0 0.75±0.5 0±0 0±0 ACV组(4μg/眼)，n=4 0±0 0.5±0.57 0.5±0.57 0.5±0.57 HSV-1+ACV孵育组(0.2μg/眼)，n=4 0±0 3.25±0.5 3.50±0.58 2.00±0.82 HSV-1+ACV孵育组(4μg/眼)，n=4 0±0 0.75±0.5 0.75±0.5 0.5±0.57

3 讨论

肉桂是重要的药用和食用植物，在我国地理分布广，资源丰富。肉桂多酚作为肉桂中水溶性部分，具有多种药理作用，包括抗糖尿病、抗氧化、抗肿瘤、神经保护等[6]，但其抗病毒方面的报道则极少。2015年Zaidi小组发现肉桂水提物及其纳米制剂在细胞水平上具有抗禽流感病毒H7N3的活性，但未与现有临床用药进行比较[7]；2016年 Prakash与Lortat-Jacob小组研究发现从肉桂提取的原花青素A型多酚能通过结合HIV-1病毒外壳糖蛋白而阻止其进入细胞，并可下调T细胞耗损标记物Tim-3、PD-1而具有抗 HIV-1活性[8]；2017年 Baumert与 Moog发现该原花青素A型多酚还能抑制HCV进入细胞，可能具有治疗HCV感染的作用[9]，但两项研究均未对其体内抗病毒活性做进一步探索。

本研究通过体外抗病毒活性和体内抗病毒药效研究评价了肉桂水提物KPC-rg1的抗HSV-1活性。首先，被 HSV-1感染的 Vero细胞加入 KPC-rg1(0.0001～1 mg/ml)后对病毒复制有抑制作用，而HSV-1与KPC-rg1(0.001～1 mg/ml)共孵育后能保护细胞不被感染。其次，KPC-rg1对HSV-1感染的动物(小鼠和树鼩)角膜病变有一定的改善作用，而KPC-rg1与HSV-1共孵育后能完全保护动物不被感染。

通过丁达尔实验观察到KPC-rg1是一种溶胶，推测其与病毒相遇后快速形成稳定的KPC-rg1/病毒超纳米颗粒结构，使病毒失去感染细胞的能力。临床上，HSV-1感染可分为原发型与复发型两型。KPC-rg1可包裹HSV-1病毒并抑制其感染细胞的特性可减少潜伏或新增殖的病毒对机体造成损伤，缓解患者反复遭受病痛折磨。。

同时，本研究也显示 KPC-rg1对 HCMV，RSV Along和HIV-1有显著的抑制活性，提示KPC-rg1可能具有广谱的抗包膜病毒活性，值得进一步深入研究。