新城疫病毒HN糖蛋白头颈部相互作用区基因突变分析

操詹魁 刘颖 迟苗苗 姜晶晶 刘晶雪 温红玲 赵丽 迟连利 王志玉

250012济南,山东大学公共卫生学院病毒学研究室(操詹魁、刘颖、迟苗苗、姜晶晶、刘晶雪、温红玲、赵丽、王志玉);250100济南,山东大学国家糖工程技术研究中心微生物技术国家重点实验室(迟连利)

新城疫病毒(Newcastle disease virus，NDV)是单股负链不分节段的RNA病毒，属于副粘病毒科禽腮腺炎病毒属，是严重危害禽养殖业发展的主要病原体之一[1]。NDV包膜上镶嵌着两种膜蛋白，分别为融合蛋白(fusion protein，F)和血凝素-神经氨酸酶(hemagglutinin-neuraminidase，HN)，两种蛋白在膜融合及致病过程中均发挥重要作用[2]。

NDV HN蛋白具有促细胞融合活性、血吸附(hemadsorption，HAD)活性和神经氨酸酶(neuraminidase，NA)活性，近年来还发现HN蛋白具有抗肿瘤效应[3]。NDV HN蛋白与其他副粘病毒吸附蛋白结构基本相似，但活性存在一定差异。根据副粘病毒吸附蛋白不同活性，可分为3类:(1)HN蛋白，具有HAD和NA活性，代表病毒为NDV和人副流感病毒(human parainfluenza virus，hPIV)；(2)H蛋白，具有HAD活性，无NA活性，代表病毒为麻疹病毒(measles virus，MeV)；(3)G蛋白，既无 HAD又无 NA活性，代表病毒为呼吸道合胞病毒(respiratory syncytial virus，RSV)[4]。关于膜融合的机制研究表明，HN蛋白首先结合宿主细胞膜表面的唾液酸受体，产生某种信号到颈部，HN和F蛋白由此产生相互作用，受到激活后，F蛋白发生一系列水解并重新折叠产生融合肽，介导细胞融合。NDV HN蛋白颈部91～112氨基酸(aa)序列与头部残基相互作用，对于头部结构的正常转换和F蛋白的激活具有重要作用[5-7]。

为了探讨不同副粘病毒吸附蛋白头颈部相互作用区(91～112)对F蛋白激活和膜融合影响，本研究设计引物构建NDV HN缺失突变体和嵌合体，通过检测突变体蛋白功能及表达效率的变化，明确NDV HN蛋白头颈部相互作用对于细胞融合的影响，为研发高效特异的抗病毒疫苗奠定一定的理论基础。

1 材料与方法

1.1 细胞与毒株 痘苗病毒重组株vTF7-3和野毒株由Moss教授(美国国家过敏和传染病研究所)惠赠，滴度分别为109PFU/ml和107PFU/ml。BHK-21细胞(乳仓鼠肾细胞)由山东省医学科学院惠赠。

1.2 质粒及菌株 载体为pBluescript SK(+)(pBSK+)质粒；pBSK+-HN、pBSK+-F重组质粒和PG1NT7β-gal质粒均由Iorio教授(美国麻省大学医学院)惠赠；NDV AV株HN基因在载体上被引入Sac I(759nt)和Xba I(731nt)两个酶切位点之间；NDV AV株F基因在载体上被引入Xho I(668nt)酶切位点；大肠埃希菌E.coil DH5α由本室保藏。

1.3 工具酶和试剂 限制性内切酶和DEME高糖培养基、胎牛血清产自美国 Thermo Fisher公司；DNA Marker和Prime STAR聚合酶产自宝生物工程有限公司；质粒提取及胶回收试剂盒产自美国Omega公司；Giemsa染色液产自Solarbio公司；神经氨酸酶及β-半乳糖苷检测试剂盒产自上海碧云天生物技术有限公司；其他试剂均为国产分析纯。

1.4 突变体构建 利用MEGA6软件将hPIV3 HN、MeV H、RSV G蛋白与NDV HN蛋白片段进行比对，定位与NDV HN 91～112 aa相应位置的基因序列。根据序列设计引物(表1)，以Sac I和Kpn I单酶切pBSK+-HN的产物为模板，分别PCR扩增出两条带有同源末端的片段，再共转化到DH5α中进行同源重组，筛选阳性克隆，双酶切鉴定成功后进行测序验证。

1.5 痘苗病毒-T7瞬时表达系统 将BHK-21细胞传入12孔板，每孔加入1 ml vTF7-3株稀释液(1:50)，提供突变体表达所需的T7 RNA聚合酶[8]。37℃孵育2 h，DMEM洗涤细胞1次，将配制完成的Exfect 2000体系转染细胞。以pBSK+空载为阴性对照，以pBSK+-HN为阳性对照。

表1 新城疫病毒HN蛋白头颈部相互作用区片段突变引物序列Tab.1 PCR primer sequences used in fragment mutagenesis of the interaction domain of the head and stalk of Newcastle disease virus HN protein

1.6 突变体蛋白功能测定 分别采用Giemsa染色和指示基因法测定各突变体HN蛋白促细胞融合活性，鸽红细胞吸附法、酶催化荧光法测定各突变体的受体识别活性、神经氨酸酶活性，具体见本室常规方法[9]。

1.7 突变体蛋白细胞表面表达强度测定 通过间接免疫荧光法(indirect immunofluorescene assay，IFA)和流式细胞术(flow cytometry，FCM)定性定量测定突变体蛋白表达；一抗为小鼠抗NDV HN蛋白单克隆抗体(1∶100稀释)，二抗为FITC标记的山羊抗小鼠IgG抗体(1∶200稀释)，具体见本室常规检测方法[10]。

1.8 统计学方法 采用SPSS21.0软件进行统计学分析，数据指标源于3次及以上独立实验结果，并以¯x±s形式表示，采用t检验比较突变体和野生型蛋白的功能差异，以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 NDV HN缺失和嵌合突变体的构建 分别以Kpn I和Sac I单酶切pBSK+-HN质粒，电泳后显示两条长度为4 799 bp的线性片段，PCR扩增后得到两条带有同源末端的片段，再共同转化到DH5α菌，提阳性质粒双酶切和 DNA测序，结果显示4个NDV HN突变体均构建成功。

2.2 NDV HN突变蛋白促细胞融合活性分析Giemsa染色结果显示，4种突变体的促细胞融合活性均显著下降，其中嵌合体Ch(MeV)，Ch(RSV)形成的合胞体相比野生型直径明显变小，数量也大幅减少；Ch(hPIV3)可见中等大小的合胞体，但数量与Ch(MeV)和Ch(RSV)无明显差异；缺失突变体De(HN)镜下未观察到合胞体产生(图1)。

定量结果显示，嵌合体Ch(hPIV3)的促细胞融合活性呈中等幅度下降，为野生型的57.84%(P＜0.05)；Ch(MeV)和Ch(RSV)促细胞融合活性分别降为野生型的24.76%和29.42%(P＜0.01)；De(HN)突变体的促细胞融合活性下降程度最大，仅为野生型的3.83%(P＜0.001)(图2)。4种突变体促细胞融合活性的定量结果与Giemsa染色结果基本一致。

2.3 NDV HN突变蛋白HAD活性分析 突变体De(HN)的HAD活性下降幅度最大，至野生型的13.48%(P ＜0.01)；突变体 Ch(MeV)、Ch(RSV)的活性也明显下降，分别为野生型的36.25%和34.93%(P＜0.05)；嵌合体Ch(hPIV3)的HAD活性较其他突变体高，为野生型的65.22%(P＜0.05)(图2)。

图1 新城疫病毒野生型和突变体HN蛋白与野生型F蛋白共表达后细胞融合情况Note:Giemsa staining(200×).Arrows indicate syncytiumFig.1 Cell fusion induced by co-expressing wt or mutant Newcastle disease virus HN proteins with wt Newcastle disease virus F protein

图2 新城疫病毒野生型和突变体HN蛋白在细胞表面表达效率及功能定量测定结果Note:Quantitative results came from three independent assays.Standard deviations are represented with error bars.Asterisk(∗)show significant differences compared with wt HN(∗ P ＜0.05，∗∗ P ＜0.01，∗∗∗ P ＜0.001)Fig.2 The analysis of cell surface expression efficiency and functions of wt and mutant Newcastle disease virus HN proteins

2.4 NDV HN突变蛋白NA活性分析 各突变体的NA活性相比野生型均出现不同程度的下降，其中De(HN)的NA活性降为野生型的10.81%(P＜0.01)；突变体 Ch(hPIV3)、Ch(MeV)和 Ch(RSV)的NA活性出现中等幅度下降，分别为野生型的60.35%、54.42%和50.13%(P＜0.05)(图2)。

2.5 NDV HN突变蛋白细胞表面表达强度分析荧光显微镜下观察显示，Ch(hPIV3)，Ch(MeV)，Ch(RSV)均有面积较大的黄绿色荧光，De(HN)仅有零星分布的荧光，在细胞表面几乎无表达(图3)。流式结果显示，各嵌合体表达效率相比野生型均不同程度下降，分别为野生型HN基因细胞表面表达效率的75.65%、82.20%、70.16%(P ＞0.05)，缺失突变体De(HN)表面效率仅为野生型的9.04%(P＜0.001)(图2)。

图3 NDV HN野生型和突变体蛋白细胞表面表达的定性分析Note:Indirect immunofluorescent assay，IIFA(200×).Arrows indicate immunofluorescence Fig.3 Qualitative results of cell surface expression level of NDV wt HN and mutant HN proteins

3 讨论

NDV HN蛋白和同源F蛋白共表达时可引起细胞融合，提示HN与F蛋白之间必定存在某种信号传导或相互作用。Welch等[11]为此提出同源四聚体头部上抬和下垂模型，即在HN蛋白结合受体前，下垂的HN头部(4-heads down)掩盖了HN 4HB中上段区域与F蛋白作用的氨基酸残基，阻碍了F蛋白与4HB区域的相互作用；HN蛋白与受体结合后，上抬的HN头部(4-heads up)暴露了HN与F蛋白相互作用区，使F蛋白激活。这里涉及到两个四螺旋束状(4HB)颈部相互作用区，一是HN颈部与F蛋白的相互作用区(49～78)，该区直接参与F蛋白的激活；另一个是HN颈部与头部的相互作用区(91～112)，其在维持头部模型的正常转换中发挥重要作用。目前，研究主要集中在HN颈部与F蛋白的相互作用区，对于HN头颈部相互作用区的片段突变研究仍未见报道。

本研究4种突变体HN蛋白的促细胞融合活性均不同程度下降，提示NDV HN头颈部相互作用区(91～112)对于HN蛋白的促细胞融合活性具有重要的影响。通过IFA和FCM定性定量测定了4种HN突变蛋白在细胞表面的表达情况，结果显示，突变体De(HN)在细胞表面表达效率仅为野生型的9.04%，接近于阴性对照结果，提示缺失突变体De(HN)促细胞融合活性的消失与其未能在细胞表面有效表达有关，这可能是91～112aa片段缺失引起蛋白异常折叠，使HN蛋白表达后不能有效转运到膜表面或者球状头部抗原活性位点失活；各嵌合体Ch(hPIV3)、Ch(MeV)、Ch(RSV)细胞表面表达效率位于70%～83%之间，与野生型相比差异无统计学意义，说明NDV HN 91～112aa片段置换不影响多肽正常折叠成HN蛋白颈部四聚体α螺旋结构。

为了确定嵌合体蛋白的促细胞融合能力的降低是否与HN球状头部活性改变有关，通过血吸附试验和神经氨酸酶试验测定突变体的HAD和NA活性，结果显示两种活性均大幅下降，且嵌合突变体HAD活性与其促细胞融合活性变化有较强的一致性，与NA活性也呈现近似正向关系。此外，MEGA单独比对结果显示hPIV3与NDV的同源性较高，推测Ch(hPIV3)相比Ch(MeV)和Ch(RSV)促细胞融合活性较强是可能与某些影响HN蛋白功能的关键氨基酸位点未发生突变或者突变未影响到原位点的活性有关。本研究中，各嵌合体NA和HAD活性均出现较大幅度的下降，可能与关键氨基酸突变后HN头部传导信号发生衰减，导致HN和F的相互作用能力减弱，不能充分激活F蛋白有关。

研究表明，副粘病毒F蛋白受到激活水解、产生融合肽是膜融合的关键步骤，而其同源吸附蛋白的构象改变是F蛋白激活的重要原因[12]。目前关于F蛋白激活的具体机制尚有一定的争论，有研究显示HN蛋白头部NA和HAD活性与HN的促细胞融合功能相互独立，无头的副粘病毒吸附蛋白突变体也能激活F蛋白导致部分融合产生，其具体机制还需进一步探讨[13]。无论如何，副粘病毒在宿主细胞中复制和增殖的过程中，HN头部识别和结合唾液酸受体是NDV包膜与宿主细胞膜融合的首要步骤，受体结合后产生的某种信号对于F蛋白激活所引发的细胞融合也具有显著的促进作用[14]。

综上所述，NDV HN头颈部相互作用区(91～112)对维持和促进HN的促细胞融合功能具有重要意义，本研究为定位头颈部相互作用区关键氨基酸，进一步研究NDV HN蛋白促细胞融合机制奠定了一定的基础。

利益冲突 无