69株鸡白痢沙门氏菌的分离鉴定及耐药性分析

刘洋 ，严专强 ，王占新 ，潘海萍 ，陈伦锋 ， 严丽端 ，覃健萍 ，鲁俊鹏 *

（1.广东温氏食品集团股份有限公司，广东 新兴 527439；2.广东温氏南方家禽育种有限公司，广东 新兴 527439）

鸡白痢沙门氏菌具有高度适应专一宿主的特点，禽类中鸡最易感，可引起雏鸡的急性败血症，多侵害3周龄以内幼雏，发病率和病死率极高；随着日龄增加对本病的抵抗力迅速上升，成年鸡亦可被感染，常导致母鸡产蛋减少，生殖道畸形，体质量下降，也导致孵化率和出雏率明显下降，鸡白痢是危害养鸡业发展的重要疾病之一[1，2]。本试验在2017～2018年期间从广东地区多个大型种鸡场采集样品进行鸡白痢沙门氏菌分离鉴定，对分离菌株进行了部分药物的耐药性分析，以期初步了解广东区域鸡白痢沙门氏菌流行动态和耐药性情况，为兽医工作者在鸡白痢的防治提供参考依据，为进一步控制和净化鸡白痢沙门氏菌奠定基础。

1 材料与方法

1.1 试验材料 亚硒酸盐胱氨酸增菌液（SC）、胰蛋白胨大豆肉汤培养基（TSB）、沙门氏菌属显色培养基、XLT4琼脂培养基、药敏纸片包括氨苄西林、氯霉素、链霉素、四环素、环丙沙星、磺胺异恶唑甲氧氨苄嘧啶、甲氧氨苄嘧啶和萘啶酸均购自环凯微生物科技有限公司；Ex Taq酶购自TAKARA。

1.2 病原和细菌分离 无菌取死胚的卵黄囊、弱雏鸡的肝脏，无菌剪碎后分别接至亚硒酸盐胱氨酸增菌液（SC）增菌，再取一环划线接种于沙门氏菌属显色培养基和XLT4培养基，进行沙门氏菌的分离鉴定。

1.3 革兰氏染色镜检 挑取纯化好的单菌落置于胰蛋白胨大豆肉汤，培养过夜。将菌液涂片固定后，再按结晶紫初染1min、碘液媒染1min、酒精脱碘30s、蕃红复染1min的步骤依次进行革兰氏染色操作，待玻片干燥后在显微镜下观察分离菌株的形态特征。

1.4 生化鉴定 取适量菌液分别接种于沙门氏菌的生化鉴定管中（三糖铁、蛋白胨水、尿素、氰化钾、赖氨酸脱羧酶、甘露醇、山梨醇、β半乳糖苷、卫矛醇），24h后观察并记录结果。

1.5 PCR扩增 根据GenBank已经公布的鸡白痢沙门氏菌ipaJ基因的保守核苷酸序列设计的鸡白痢沙门氏菌的特异性引物进行PCR扩增[3]，20μl反应体系：Ex Taq 酶 10μl，无菌水 8μl，上下游引物各 0.5μl，菌液1μl。PCR反应程序95℃预变性 5min；94℃变性 30s，55℃退火 30s，72℃延伸30s，30循环；72℃后延伸10min。将PCR产物进行电泳检测，扩增产物目的片段为161bp。

1.6 药敏试验 采用药敏片法对8种抗菌药物进行药敏试验，以测定菌株对抗菌药物的敏感性和不同菌株之间的差异。

2 结果与分析

2.1 分离菌株形态 在显色琼脂培养基上形成圆形、光滑凸起的紫红色菌落，XLT4琼脂培养基上长出圆形、无色透明的菌落；经革兰氏染色后显微镜观察，分离的细菌为革兰氏阴性、两端钝圆短杆菌。

2.2 生化鉴定和PCR鉴定结果 生化试验结果表明，这69个分离株在三糖铁琼脂（TSI）试验中均产酸、斜面变红，蛋白胨、尿素、氰化钾、山梨醇、卫矛醇和β-半乳糖苷酶均为阴性，赖氨酸脱羧酶阳性，其中14个分离株表现为甘露醇阴性，其余分离株均为阳性，参照生化鉴定试剂盒的说明书进行判断，69个分离株均为沙门氏菌，将其进行鸡白痢的特异性PCR，69个分离株均能扩增出目的片段。

2.3 药敏试验结果 69株沙门氏菌对8种药物的敏感性见下表1所示。由表1可知，50个分离株表现出多重耐药，69株受试菌株均对环丙沙星表现出敏感，10.14%的菌株对氯霉素耐药，24.64%的菌株对四环素耐药，28.99%的菌株对链霉素耐药，57.97%的菌株对氨苄西林耐药，62.32%的菌株对萘啶酸耐药，71.01%的菌株对甲氧氨苄嘧啶耐药，72.46%的菌株对磺胺异恶唑甲氧氨苄嘧啶耐药。

3 讨论

鸡白痢是一种急性的系统性疾病，可引起种蛋受精率、孵化率和健苗率降低及死胚率、弱胚率和弱雏率升高等，给养禽业造成了巨大的损失。但是目前预防鸡白痢沙门氏菌并无有效的疫苗，只能通过淘汰阳性鸡和用药来控制[4]。因此，需要种鸡场严格遵守定期检疫淘汰制度，淘汰感染鸡，做好种鸡场的净化、种蛋消毒、加强雏鸡饲养管理、药物防控和卫生措施等环节，保持鸡舍干燥、清洁，切断水平传播和垂直传播。

本研究在2017～2018年期间成功在广东地区分离出69株鸡白痢沙门氏菌。药敏试验发现这69个分离株对8种药物的敏感性具有差异，其中所有受试菌株仅对环丙沙星表现出极度敏感，其他分离株均表现出不同程度的耐药和多重耐药，同一地区分离株之间也具有差异。这与其他关于鸡白痢沙门氏菌的抗菌药物耐药结果类似[5-7]。因此，在临床用药预防和治疗某种疾病时，临床用药必须结合药敏试验进行轮换用药和联合用药。当然，药物防控是不得已而为之，最重要的还是加强鸡场的饲养管理，定期监测、淘汰疑似阳性鸡，逐步净化鸡群，提高鸡群健康度。

表1 分离株药敏试验结果