脑特异性新生血管抑制因子1在结直肠癌中的表达及其与结直肠癌患者临床病理学特征的关系

魏建昌　胡鹤　王强

[摘要] 目的 探究腦特异性新生血管抑制因子1（BAI1）在结直肠癌中的表达与结直肠癌患者临床病理学特征的关系。 方法 2016年5月～2017年7月，购买包含有208个结直肠癌和8个正常结肠组织及其临床信息的组织芯片。查询癌症基因组图谱数据库，内含192例结直肠癌患者的mRNA表达信息。通过免疫组化检测组织芯片正常结肠组织与结直肠癌组织中BAI1表达的情况，检测BAI1表达与结直肠癌患者临床病理特征的关系，采用Kaplan-Meier法和Log-rank秩检验方法进行生存曲线。最后使用Cox回归模型进行单变量分析和多变量分析，判断BAI1对预后的判断价值。 结果 BAI1在结直肠癌组织中的含量较正常组织显著上升（P < 0.001）。高BAI1表达与临床分期（P = 0.004）和肿瘤浸润（P = 0.006）相关。癌症基因组图谱（TCGA）中结直肠癌患者的BAI1 mRNA表达进一步提示了较晚的临床分期（P = 0.027）、较严重的肿瘤浸润（P = 0.021）的结直肠癌中BAI1表达水平更高。Kaplan-Meier生存曲线提示BAI1 mRNA高表达的患者比低表达水平的患者总生存期明显减少（P = 0.02）。BAI1 mRNA的高表达是结直肠癌预后的独立影响因素（HR = 2.895，95%CI：1.012～8.281，P = 0.047）。 结论 BAI1与结直肠癌的恶性相关。BAI1的高表达可能提示结直肠癌患者的不良预后。

[关键词] 脑特异性新生血管抑制因子1；结直肠癌；临床病理学特征；独立预后因素

[中图分类号] R442.8 [文献标识码] A [文章编号] 1673-7210（2018）07（b）-0008-04

Expression of brain-specific angiogenesis inhibitor 1 in colorectal cancer and its correlations with clinicopathological features of colorectal cancer patients

WEI Jianchang* HU He* WANG Qiang CHEN Zhuanpeng YANG Ping ZHANG Tong CAO Jie

Digestive Disease Center， the First People′s Hospital of Guangzhou City， Guangzhou Medical University， Guangdong Province， Guangzhou 510180， China

[Abstract] Objective To explore the roles of brain-specific angiogenesis inhibitor 1 in colorectal cancer and its correlations with clinicopathological features and prognosis of CRC patients. Methods Fom May 2016 to July 2017， tissue microarray with 208 CRC， 8 normal colon tissues and the clinical information was purchased. The cancer genome atlas （TCGA） dataset is a publicly available dataset with 192 primary CRC patients and the mRNA expressions. BAI1 in TMA of CRC and benign glandular epithelium cells was checked by immunohistochemistry. The exlpore the connection between the express of brain-specific angiogenesis inhibitor 1 with clinicopathological features. Overall survival curve was analyzed by Kaplan-Meier method and Log-rank test. Univariate analysis and multivariate analyses were analyzed with Cox proportional hazards regression to assess the prognostic value of high BAI1 expression for CRC patients. Results BAI1 was localized in the cytoplasm of CRC and benign glandular epithelium cells， showing higher protein levels in CRC tissues compared with normal colon samples （P < 0.001）. High BAI1 protein expression was associated with high pathological grade （P = 0.039）， advanced clinical stage （P = 0.004） and enhanced tumor invasion （P = 0.006）. The cancer genome atlas （TCGA） mRNA expression further showed that BAI1 was upregulated in CRC with advanced clinical stage （P = 0.027） and enhanced tumor invasion （P = 0.021）. Kaplan-Meier survival curves revealed that CRC patients with higher BAI1 mRNA levels had shorter overall survival than those with lower expression （P = 0.02）. High BAI1 mRNA expression was an independent influence of factor for prognosis of CRC （HR = 2.895； 95%CI： 1.012-8.281； P = 0.047）. Conclusion BAI1 ralates to aggressive CRC. High BAI1 expression may predict poor prognosis of CRC patients.

[Key words] Brain-specific angiogenesis inhibitor 1； Colorectal cancer； Clinicopathological features； Independent prognostic factor

结直肠癌（colorectal cancer，CRC）是一种常见的消化恶性肿瘤，在全球癌症相关死亡排名中排名第四[1]。目前虽然已经发现一些基因与CRC进展密切相关[2-3]，但是完整的分子机制仍是不确定。因此，有必要寻找新的标志物，并进一步阐明CRC的生物学特性，从而改善治疗效果，改善患者预后。

脑特异性血管生成抑制因子1（brain-specific angiogenesis inhibitor 1，BAI1）主要表达于人脑，位于细胞浆和细胞膜当中，当以基因转染的方式在培养细胞中表达时，主要表达在细胞膜上[4]，是黏附G蛋白偶联受体家族的一员[5]。作为一种膜蛋白，BAI1的胞外区域包含有5个TSP-1型重复序列和7个跨膜区域，由野生型p53诱导生成。其主要功能为抗血管生成[6-7]。几项研究表明，在包括肺腺癌[8]、胃癌[9]、胶质母细胞瘤[10-12]在内的几种癌症中，BAI1 mRNA表达水平下调了。并且最近有人发现在肾癌中BAI1 mRNA和蛋白水平降低，且与微血管密度呈负相关，这说明了BAI1可能可以作为肾癌临床基因治療的一个突破口[13-14]。Meisen等[15]还发现，在乳腺癌中，BAI1表达明显降低，且高表达水平与较好的预后有关。然而，关于BAI1在结直肠癌中的作用仍是不清楚的，本研究探讨结直肠癌中BAI1的表达及其与结直肠癌患者临床病理学特征的相关性，具体如下：

1 材料与方法

1.1 组织样本

组织芯片（TMA，Cat No. CO2161）从艾丽娜生物技术有限公司（西安）购买，包含208个结直肠癌、8个正常结肠组织及对应患者的临床信息。本研究排除了在手术前接受化疗或放疗的患者。癌症基因组图谱（The cancer genome atlas，TCGA）数据库是一个公开的数据库，包含192例结直肠癌患者的mRNA表达信息及临床数据（http：//www.cbioportal.org/study.do？cancer_study_id=coadread_tcga_pub）。

1.2 免疫组织化学测定

使用DakoEnVision Systems（Dako Diagnostics，Switzerland）进行免疫组织化学测定。通过蛋白水解消化和过氧化物酶处理组织芯片，再使用兔的抗人BAI1多克隆抗体（ab135907，1∶100，Abcam）在4℃的环境中孵育一晚。用磷酸盐缓冲液清洗之后，加入过氧化物酶标记抗体和底物染色剂，以显示蛋白质的表达情况。

1.3 免疫组化评分

由艾丽娜生物技术有限公司（西安）扫描组织芯片，使用ImageScopev11软件（美国加州Vista，CA）进行评估。由2名病理学家分别对染色水平进行了半定量评估。组织的染色强度评分：无染色记为0分；弱染色记1分；中度染色记2分；强染色记3分。在同一时间内评估标本的染色百分比：0～25%记1分；>25%～50%记2分；>50%～75%记3分，>75%～100%：记4分。免疫组化评分（immunoreactivity score，IRS）由强度和染色百分比两者相乘，0～12分。对比2名病理学家给出的评分，如有不同则二人协商一致。以此评价BAI1表达水平，并将样本分为高表达（IRS> 4分）和低表达（IRS≤4分）两组[2]。

1.4 统计学方法

采用SPSS 21.0统计学软件进行数据分析，计量资料用均数±标准差（x±s）表示，两组间比较采用t检验；计数资料用率表示，组间比较采用χ2检验；采用Kaplan-Meier法和Log-rank秩检验方法对生存曲线进行分析；采用Cox回归模型进行单变量分析和多变量分析。以P < 0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 结直肠癌组织和正常结肠组织中BAI1表达水平的比较

对组织芯片进行免疫组化染色，检测BAI1蛋白水平（图1A，封三）。如图1C～E（封三）所示，在结直肠癌细胞和正常腺上皮细胞的细胞质中，BAI1有不同表达。按IRS将将样本分为高表达和低表达两组。193个CRC样本中（免疫组化染色后遗失了15个组织样本），20例（10.4%）表现为BAI1低表达，173例（89.6%）为BAI1高表达。8例正常结肠组织中，7例（87.5%）表现为BAI1低表达，1例（12.5%） 为BAI1高表达。结直肠癌组织中的BAI1水平高于正常结肠组织（P < 0.001）（图1B，封三）。

2.2 组织芯片中结直肠癌组织中BAI1高表达与结直肠癌的临床分期以及肿瘤浸润的关系

将组织芯片结直肠癌样本按临床病理特征分类，进一步评估BAI1表达水平与结直肠癌患者的临床病理特征是否有关。BAI1高表达与临床分期（P = 0.004）以及肿瘤浸润（P = 0.006）有关。见表1。

2.3 临床病理学特征与男性结直肠癌患者BAI1 mRNA表达水平的关系

为了进一步验证组织芯片的发现，本研究分析了来自TCGA的原发结直肠癌患者的mRNA表达情况。202例男性结肠癌患者，排除其中10例临床资料不完整者。结直肠癌组织中，较晚的临床分期（P = 0.027）和较深层次的肿瘤浸润（P = 0.021）对应的BAI1 mRNA表达水平更高。男性样本较女性而言，BAI1 mRNA表达水平更高（P = 0.036）。见表2。

2.4 BAI1高表达与结直肠癌预后的关系

为了解BAI1高表达与结直肠癌患者预后的关系，取TCGA的数据库里BAI1表达水平均值为（13.72±29.59），以此为标准将病例为高、低BAI1表达组[2]，用Kaplan-Meier曲线来比较BAI1 mRNA水平高和低的患者的临床结果之间的不同（图2）。高低BAI1表达组手术后的总生存期分别为（36.367±4.362）、（36.367±4.827）个月。与低表达组比较，高表达组结直肠癌患者总生存期较短（Log-rank= 5.44，P = 0.02）。采用Cox回归模型处理TCGA组数据，检测BAI1与结直肠癌患者预后的关系。单变量分析提示BAI1是结直肠癌一个有价值的预后因子（HR = 3.147，95%CI：1.136～8.716；P = 0.027）。多变量分析进一步确定BAI1高表达是CRC的一个独立预后因子（HR = 2.895，95%CI：1.012 ～8.281；P = 0.047）。见表3。

3 讨论

BAI1是肿瘤抑制因子TP53[6]的目标基因，结构中有一个胞外区域，由5个TSP-1型重复序列和7个跨膜区域构成[5]，3个TSP-1重复序列构成的重组多肽具有抗血管生成活性[6]。并且BAI1被认为可能是p53的抗血管生成作用的旁分泌效应的受体[16]。

也有一些研究表明，BAI1在癌组织中表达下调了，并且BAI1主要起到了血管生成抑制剂的作用[17-18]。Fukushima等[19-20]于1998年首次在結直肠癌中检测到BAI1，发现其表达被下调，并与血管侵袭、转移呈负相关，故认为BAI1可能抑制了结直肠癌的血管生成和转移。

然而，本研究发现了相反的结果。如前所述，BAI1主要存在于结直肠癌细胞的细胞质中，与正常的结肠组织相比，其表达是升高的。且BAI1的表达上调与临床分期、肿瘤浸润有关。通过对TCGA中结直肠癌患者的BAI1 mRNA表达情况的研究进一步验证了这些发现。在此基础上，确定了较晚的临床分期和肿瘤浸润增强与BAI1上调有着重要关联。本研究观察到BAI1高表达与CRC的远处转移没有相关性，这可能与M1组样本容量有限有关。

进一步比较TCGA中不同BAI1表达的结直肠癌患者的总生存期，BAI1高表达的患者总生存期较短。通过Cox回归模型可知BAI1高表达可能是结直肠癌患者预后的一个独立预测因子。

综上所述，本研究可得出BAI1与结直肠癌的恶性相关，BAI1高表达可能是CRC患者预后的一个独立预测因子。但在CRC中，BAI1的作用仍是有争议的，具体机制尚不明确，对其进一步研究是必要的。

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（收稿日期：2017-12-18 本文編辑：任 念）