叶酸修饰氧化石墨烯装载松针木栓酮联合微波释药的抗肿瘤研究

李启照，钱溪溪，陶方红

(安徽新华学院 药学院，安徽 合肥 230088)

胃癌在我国各种恶性肿瘤中居首位，目前主要是通过手术治疗切除病灶部位或化疗放疗进行医治，对人体伤害极大.研究表明，植物活性成分黄酮类化合物可通过抗氧化、激素调节、抑制肿瘤细胞增殖和转移、促进肿瘤细胞分化和凋亡等途径发挥抗肿瘤作用，疗效确切[1].雪松是松科雪松属植物的总称，具有活血消肿、祛风活络、抗菌、抗病毒以及抗氧化等功效[2].叶酸修饰的氧化石墨烯是一种很有前途的靶向抗癌药物载体[3].而微波释药则广泛应用于肿瘤细胞抑制的辅助治疗.本实验是利用氧化石墨烯叶酸组装松针木醛酮进行SGC-7901抑制胃癌细胞增殖的实验研究，目的是为松针活性成分的抗胃癌作用研究提供研究参考.

1 材料与方法

1.1 材料

雪松(Cedrusdeodara)松针采自中国安徽省大别山金寨县；天然鳞片石墨粉(粒径约为40～50 μm)，纯度99.9%，青岛欧尔石墨有限公司；叶酸，氮-羟基琥珀酰亚胺，sigma；1-乙基-(3-二甲氨基丙基)碳化二亚胺，Aldrich；透析袋，宽度34 mm，容量3.4 mL/cm，截留分子量8 000～14 000，国药集团化学试剂有限公司；胃癌细胞系SGC-7901，安徽医科大学；RPMI-1640 培养基，胎牛血清(FBS)，上海尚宝生物科技有限公司；MTT试剂盒，上海碧云天生物科技有限公司；其余试剂均为分析纯.

1.2 仪器

水平摇床，北京六一仪器有限公司；电子天平，上海精密科学仪器有限公司；sigma超速冷冻离心机，德国sigma公司；85-2A 控温恒速搅拌器，上海德洋意邦仪器有限公司；JY98-III 超声波细胞粉碎机，宁波新芝生物科技股份有限公司；PS-100A 超声波清洗器，昆山超声波清洗器有限公司；美国Agilent 6890N气相色谱仪，FID检测器；酶标仪(BXS01-ELx-800)，美国宝特酶标仪；VG Auto-Spec-3000质谱仪，英国Micromass公司.

1.3 实验方法

1.3.1 松针木栓酮的制备与纯化

雪松松针干燥粉末(约2.5 kg)用95%乙醇(4×8 L)提取，减压浓缩至无乙醇气味，加水悬浮，分别用石油醚(3×4 L)、氯仿(3×4 L)、乙酸乙酯(3×4 L)和正丁醇(3×4 L)依次萃取，减压浓缩得浸膏,其中,石油醚部分42.0 g、氯仿部分39.0 g、乙酸乙酯部分85.0 g，正丁醇部分187.0 g.

乙酸乙酯部分经硅胶柱色谱，得6个部分(Fr.1～Fr.6).Fr.5经减压浓缩得到黑色浸膏，反复硅胶色谱(氯仿：甲醇为9：1～5：5，v/v)，用Sephadex LH-20凝胶柱(氯仿：甲醇为1：1，v/v)纯化，得到木栓酮18.7 mg.

1.3.2 氧化石墨烯(GO)的制备与纯化

氧化石墨烯采用Hummers制备：移取200 mL浓硫酸，在冰浴条件下放置一段时间，使其温度接近冰浴温度.在不断搅拌的条件下将5 g石墨粉加入到浓硫酸中，再称取18 g高锰酸钾加入到浓硫酸里，保持冰浴条件下搅拌3 h，使之混匀.从冰浴中取出反应液，并在室温条件下继续搅拌5 d，回到冰浴条件下，然后加入18 g高锰酸钾，持续搅拌3 h重复上述步骤一次.量取46 mL水，逐滴缓慢加入，使混合物保持较低温度，然后将其放在90～100 ℃水浴中，继续搅拌反应30 min，从热水浴中取出后加入140 mL水和30%(质量分数)的双氧水，待变为亮黄色后，混匀离心分离，最后分别使用无水乙醇和质量分数为5%盐酸对离心产物进行离心清洗至中性，在恒温干燥箱50 ℃下烘干即得到氧化石墨烯.

取适量干燥后的氧化石墨烯，加入50 mL蒸馏水，在冰浴条件下，使用超声粉碎机在500 W的功率下对混合物进行超声震荡1 h，获得棕黄色的分散液，将分散液在12 000 r/min下离心15 min，收集棕黄色上清液，将沉淀再次加入到蒸馏水中，重复上述步骤，最终得到氧化石墨烯水溶液.

在氧化石墨烯的水溶液中加入适量蒸馏水，再用截留分子量为8 000～14 000的透析袋透析2 d，获得的滤液即为氧化石墨烯的分散液.

1.3.3 叶酸修饰氧化石墨烯制备

向氧化石墨烯分散液中依次加入5 g NaOH，5 g NaClO，超声处理2 h.待反应完全后用稀盐酸对溶液进行重复漂洗，漂洗完成后，将反应液分离，在8 000 r/min的条件下离心20 min，去除沉淀，获得上层黑色溶液.将收集到的黑色溶液用蒸馏水透析48 h，去除未反应的物质.

向透析液中加入0.5 g叶酸，超声处理使其均匀分散.在搅拌条件下加入1-乙基-(3-二甲氨基丙基)碳化二亚胺(EDC)和氮-羟基琥珀酰亚胺(NHS)，超声处理2.5 h后使用NaHCO3溶液(pH=8)对混合液进行透析处理48 h，每4 h更换一次NaHCO3溶液，将得到的黑色溶液使用旋蒸仪去除其中的水分，使用丙酮对黑色沉淀进行反复洗涤，于40 ℃下真空干燥，得到氧化石墨烯叶酸修饰物，记为FA/GO.

1.3.4 松针黄酮(PNF)对FA/GO的负载实验

将0.05 g FA/GO加入到50 mL乙醇中，超声0.5 h使其分散，然后向分散液中缓慢滴入1 mL质量浓度为2 mg/mL的松针木栓酮，避光搅拌24 h，待反应完全后将烧杯中的合成液在12 000 r/min条件下离心1.5 h，去除沉淀物，可得负载了松针木栓酮的FA/GO分散液，记为FA/GO/PNC，利用气相色谱法可计算出负载在分散液上的松针木栓酮的量.计算公式为

FA/GO/PNC上的松针木栓酮量=初始加入的松针木栓酮含量—上层清液中松针木栓酮含量，

式中：上层清液中的松针木栓酮含量可通过气相色谱法测量离心后上层清液480 nm，然后对照绘制的松针木栓酮标准浓度曲线后计算所得.离心后下层物质在恒定温度为30 ℃的真空干燥箱中干燥12 h.

1.3.5 FA/GO/PNC中松针木栓酮的缓释实验

取干燥后的FA/GO/PNC作为样品加入到乙醇中，混合后装入透析袋中，扎紧，移入1 000 mL锥形瓶，加入300 mL乙醇于锥形瓶中，置于恒温超声仪中，保温37 ℃.利用微波辐射仪对锥形瓶中的药物进行辐射，设置微波功率为20～200 W，辐射时间为30～300 s,每隔30 s取1 mL透析袋外的乙醇，并加入1 mL乙醇，以保证瓶中乙醇总体积不变.气相色谱法检测其浓度.另一组不给予微波辐射仪处理.绘制松针木栓酮浓度-峰面积曲线，并根据这个曲线独处ti时刻取出的乙醇中的木栓酮浓度Cti，按照下列公式计算出松针木栓酮的累积释放率(S%).

S%=(CtiVti+∑CtiVti)/(C0V0-C1V1)×100，

其中：S%表示释放量，V表示乙醇的体积，C0表示初始加入的松针木栓酮的浓度，V0表示初始加入的松针木栓酮的体积，C1表示载药后经离心所得的上清液中药物浓度，V1表示载药后经离心所得的上清液体积，Ct表示t时刻取出的乙醇中药物的浓度，Vt表示t时刻取出的乙醇的体积.

1.3.6 FA/GO/PNC与FA/GO对胃癌细胞的体外抑制实验

胃癌细胞SGC-7901接种于完全培养液中，置于37 ℃、5% CO2饱和湿度培养箱中培养，0.25%胰酶消化传代培养.取对数生长期的胃癌细胞SGC-7901制备细胞悬液，每孔5 000个细胞接种于 96 孔板中，每孔加入 100 μL完全培养液待24 h细胞贴壁后吸尽完全培养液.空白组组加入完全培养液，阴性组分别加入浓度为.0.5、1、2、4、8 μg/mL的FA/GO完全培养液，实验组分别加入浓度为 0.5、1、2、4、8 μg/mL的FA/GO/PNC完全培养液，每个处理组均设5个复孔，微波处理条件下分别置于培养箱24h后，每孔加MTT溶液(5 μg/mL用PBS配制，pH=7.4)20 μL.孵育4 h终止培养，轻轻吸弃培养孔内上清液.每培养孔内加入150 μLDMSO，振荡10min，使结晶物充分融解.酶标仪测定570 nm 波长处的吸光值(OD) .实验重复 3 次.按以下公式计算FA/GO/PNC对胃癌细胞的抑制率.

细胞增殖抑制率(%)=(对照组OD-阴性组OD)/对照组OD×100.

1.3.7 Western blot法

根据MTT法结果，分别使用2 μg/mL FA/GO/PNC、FA/GO和完全培养基联合微波处理胃癌细胞SGC-7901 48 h，提取蛋白质后采用BCA法测定其总蛋白含量.分别取各组40 μg总蛋白上样，随后将蛋白转移至PVDF膜上，5%脱脂奶粉封闭后，加入适量Bax(1:1 000)、β-actin(1：2 000)、Akt(1：1 000)或p-Akt(1：1 000)一抗，4 ℃孵育过夜，加入二抗(1：4 000)，室温下摇荡孵育2 h，采用ECL发光液发光，X线片压片、显影、定影.采用Gel-Pro analyzer分析各显影条带的 A值(p-Akt与Akt的A值比值，Bax与β-actin的A值比值).

2 结果与分析

2.1 结构鉴定

图1 松针木栓酮结构式

白色固体(乙醇)；ESI-MS正离子模式下给出准分子离子峰m/z：428 [M + H]+，450 [M + Na]+，其相对分子质量为427.结合其NMR数据，推断分子式为C30H50O，1H-NMR (CDCl3，500 MHz)δ：1.97 (1H，m，H-1a)，1.70 (1H，m，H-1b)，2.38 (1H，dd，J=13.3，4.8 Hz，H-2a)，2.32 (1H，dd，J=13.1，7.3 Hz，H-2b)，2.23 (1H，d，J=6.3 Hz，H-4)，1.75 (1H，m，H-6)，0.87 (3H，s，H-23)，0.76 (3H，s，H-24)，0.88 (3H，s，H-25)，0.99 (3H，s，H-26)，1.00 (3H，s，H-27)，1.14 (3H，s，H-28)，1.03 (3H，s，H-29)，0.97 (3H，s，H-30)；13C-NMR (CDCl3，125 MHz).以上数据与文献[6]报道对照基本一致，故鉴定为木栓酮，见图1.

2.2 FA/GO对松针木栓酮的负载实验

将松针木栓酮作为药物模型分析松针木栓酮在FA/GO上的负载效果，结果表明，FA/GO对松针木栓酮的负载率为67.2%，即每0.05 g FA/GO可负载1.34 g松针木栓酮.FA/GO与未经修饰的氧化石墨烯相比，载药率相差较小.

2.3 FA/GO/PNC的药物缓释研究

FA/GO上负载的松针木栓酮在微波处理条件下对其药物释放过程进行观察，如图2所示.在160 h内药物的释放率呈递增趋势，具有较好的缓释性.当释放160 h时，在微波处理条件下，药物的累积释放率为45.68%；而当不用微波处理时，药物的累积释放率为33.46%.并且在40～160 h内，在微波处理条件下药物的释放率较高.

2.4 FA/GO/PNC与FA/GO对胃癌细胞的体外抑制实验

采用胃癌细胞系SGC-7901作为模型，对FA/GO/PNC和FA/GO对胃癌细胞的抑制率进行了研究，见图3.结果表明当FA/GO/PNC浓度为8 μg/mL时，对胃癌细胞系SGC-7901的抑制率达到86.12%.而且当FA/GO浓度为8 μg/mL时，抑制率为30.85%，众所周知，微波对癌细胞具有一定的抑制作用，故证明FA/GO作为药物载体具有一定的安全性.

图2 微波处理和无微波处理下的药物释放曲线

图3 FA/GO/PNC与FA/GO对胃癌细胞的抑制率

2.5 FA/GO/PNC对bax蛋白及PI3K/Akt信号通路的影响

Western结果显示:当使用2 μg/mL FA/GO/PNC联合微波处理胃癌细胞系SGC-7901 48 h后,Bax蛋白表达比值明显上升，而P-Akt/Akt比值明显下降，FA/GO组与空白组Bax蛋白表达比值和P-Akt/Akt比值均无明显差异.

3 结论

采用叶酸修饰氧化石墨烯后装载松针木栓酮，联合微波释药法利用MTT法，以胃癌细胞SGC-7901为模型，考察了一种新型的以氧化石墨烯为基础的药物载体(FA/GO)的载药能力、在于微波联用下缓释能力、对癌细胞的抑制率，以及对PI3k/Akt信号通路的影响，获得了较好结果，该材料对松针木栓酮的载药率为67.2%，具有较好的应用前景.在运用微波联合处理时发现，微波对该载体系统释药具有较强作用，可对胃癌细胞起到一定的直接抑制作用.

实验采用FA/GO/PNC联合微波处理胃癌细胞系SGC-7901后，P-Akt/Akt蛋白比例明显下降，提示松针木栓酮可能通过抑制PI3k/Akt信号通路，从而抑制胃癌细胞增殖.松针作为药材研究并不多，而木栓酮这一类氧化环烷烃类化合物因为其溶解性较差，故其抗癌效果的研究也较少.该实验通过构建GA/GO/PNC，既解决了松针木栓酮溶解性较差的问题，又通过联合微波局部照射，做到了药物地靶向释放，为传统药物化合物的提取及制剂提供了新的研究思路.