蛹虫草多肽的提取及体外抗氧化活性研究

赵琳琳　张鑫喆　徐方旭

摘 要：采用酶解法获取蛹虫草子实体中的多肽，并对中性蛋白酶和木瓜蛋白酶提取出的蛹虫草多肽进行体外抗氧化活性的测定。结果表明，蛹虫草多肽具有一定的还原能力、清除DPPH的能力和清除羟自由基的能力，并且采用木瓜蛋白酶提取出的多肽活性均优于用中性蛋白酶提取出的多肽。这为以后蛹虫草多肽在医学、食品及保健品等领域广泛应用提供了重要理论基础。

关键词：蛹虫草；多肽；蛋白酶；抗氧化

DOI：10.16640/j.cnki.37-1222/t.2018.19.041

0 引言

蛹虫草[Cordyceps militaris（L.）Link]是一种和冬虫夏草同属异种的药食兼用真菌，又名北冬虫夏草。研究表明蛹虫草含有与冬虫夏草相近的功能物质及药用功效[1]。蛹虫草含有蛋白质、虫草酸、脂肪、SOD酶、虫草素、虫草多糖和很多微量元素。众所周知，多肽是机体完成各种生理活性必不可少的一种物质，在生物的代谢活动和疾病治疗中也有着举足轻重的作用，因此该研究现已成为一大热点[2]。但目前国内外的学术研究，有关蛹虫草多肽内容的很少，大部分都围绕虫草素和虫草多糖的研究。本文对蛹虫草子实体中多肽的提取、及体外抗氧化活性进行研究，旨在为日后蛹虫草多肽类物质的研究及其应用提供参考意见。

1 材料与仪器

1.1 材料与试剂

蛹虫草子实体、30%过氧化氢溶液、无水乙醇、硫酸亚铁、水杨酸、蒸馏水、磷酸氢二钠、磷酸二氢钠、DPPH、铁氰化钾、三氯乙酸、三氯化铁、木瓜蛋白酶、中性蛋白酶。

1.2 仪器设备

粉碎机、恒温水浴锅、分光光度计、离心机、电子天平、筛子、锥形瓶等。

2 实验方法

2.1 多肽的提取

将蛹虫草磨成粉用筛子过滤后，取6个150ml锥形瓶加入10 g虫草粉、90ml蒸馏水，三个分别加0.5 g木瓜蛋白酶和中性蛋白酶，室温下充分溶胀30min后放入恒温水浴锅中3 h，调节温度为55 ℃和50 ℃。酶解完成后沸水浴煮沸10 min，离心（4000 r/min）10 min得上清即为肽类物质。

2.2 蛹虫草多肽体外抗氧化活性研究

2.2.1 蛹虫草多肽对羟自由基清除能力的测定

采用水杨酸法测定。取1.0mL待测液于试管中，分别加入0.2mL过氧化氢溶液，0.2mL硫酸亚铁溶液，0.2mL水杨酸-乙醇溶液和3.4mL蒸馏水，振荡摇匀放后在37℃的恒温水浴锅内30min后拿出。空白组为蒸馏水，对照组为不加待测液的反应液。将分光光度计波长调为510nm，分别测定对照组和待测液的吸光值。每个实验重复三次。

羟自由基（-OH）清除率的计算公式为：E-OH=（A对照-A样品）/A对照×100%

2.2.2 蛹虫草多肽还原力测定

采用铁氰化钾还原法测定。取1.0mL待测液于试管中分别加入2.5mL磷酸缓冲液（PH7.0）、1.5mL蒸馏水、2.5mL铁氰化钾溶液。振荡摇匀后在50℃的恒温水浴锅内20分钟后迅速拿出冷却。再加入2.5mL三氯乙酸溶液，3000r/min离心10min，取上清液2.5mL放入新试管中，加入2.5蒸馏水和0.5mL三氯化铁溶液，充分混匀后常温下静置10min。将分光光度计波长调为700nm，测定吸光值。吸光值越大，说明测定物的还原力越强。每个实验重复三次。

2.2.3 蛹虫草多肽对DPPH自由基清除能力的测定

取1.0mL待测液于试管中，分别加入1.5mLDPPH溶液、1.5mL蒸馏水，振荡摇匀后在25℃的恒温水浴锅内30min后拿出。空白组为1.5mL无水乙醇和1.5mL蒸馏水混合均匀后的反应液。对照组为1.5mLDPPH溶液和1.5mL蒸馏水混合均匀后的反应液。将分光光度计波长调为517nm，分别测定对照组和待测液的吸光值。每个实验重复三次。

DPPH自由基清除率的计算公式：EDPPH=（A对照-A样品）/A对照×100%

3 结果与分析

3.1 蛹虫草多肽对羟自由基清除能力

从图1可以看出，蛹虫草多肽对羟自由基具有一定的清除能力。从三次的测定结果来看，木瓜蛋白酶提取的蛹虫草多肽对于羟自由基的清除能力均要好于中性蛋白酶提取的蛹虫草多肽，从平均值可以看出，木瓜蛋白酶和中性蛋白酶提取的蛹虫草多肽对于羟自由基的清除能力分别为66.1%和52.7%。由此可见，木瓜蛋白酶更适合于蛹虫草多肽的提取。

3.2 蛹虫草多肽还原力

从图2可以看出，蛹虫草多肽具有一定的还原能力。从三次的测定结果来看，木瓜蛋白酶提取的蛹虫草多肽还原能力均要好于中性蛋白酶提取的蛹虫草多肽。木瓜蛋白酶提取出的蛹虫草多肽还原力吸光值平均值为2.60，中性蛋白酶提取出的蛹虫草多肽还原力吸光值平均值为0.190。由此可见，木瓜蛋白酶更适合于蛹虫草多肽的提取。

3.3 蛹虫草多肽对DPPH自由基清除能力

从图3可以看出，蛹虫草多肽对DPPH自由基具有一定的清除能力。从三次的测定结果来看，木瓜蛋白酶提取的蛹虫草多肽对于羟自由基的清除能力均要好于中性蛋白酶提取的蛹虫草多肽，从平均值可以看出，木瓜蛋白酶和中性蛋白酶提取的蛹虫草多肽对于羟自由基的清除能力分别为89.1%和88.2%。由此可见，木瓜蛋白酶更适合于蛹虫草多肽的提取。

4 结论

从上述蛹虫草多肽体外抗氧化活性测定的三个实验结果，可以看出用中性蛋白酶和木瓜蛋白酶提取出的蛹虫草多肽都具有一定的对羟自由基的清除能力、还原能力以及对DPPH自由基的清除能力。并且用木瓜蛋白酶提取出的蛹虫草多肽，上述这三种能力都优于中性蛋白酶提取出的蛹虫草多肽。由此可见，用木瓜蛋白酶提取出的蛹虫草多体外抗氧化活性更强，说明木瓜蛋白酶比中性蛋白酶更适合于对蛹虫草多肽的提取。

参考文献：

[1]江苏新医学院.中药大辞典[S].上海：上海人民出版社，1975：

767.

[2]李卫林，汤克勇，曹键.生物活性多肽的应用研究[J].粮食加工，2005（02）：45-47.

[3]宗静，李竞.蛹虫草子实体中多肽的提取分离及组成初探[J].中国医药指南，2011，9（35）：315-316.

[4]徐鸿雁.蛹虫草多肽的制备及分离[D].西北农林科技大学，2013.

[5]苗信凯.蛹虫草多肽制备分离及功能口服液加工工藝研究[D].天津科技大学，2015.