大黄素抑制脂多糖诱导星形胶质细胞炎症反应的机制研究

林 昱，赖文芳，苏燕青，宋百颖，黄 鑫，洪桂祝

(福建中医药大学药学院，福建 福州 350122)

在中枢神经系统中，星形胶质细胞是数量最多的一类功能调节细胞，在正常生理条件下，为神经元提供信息加工、支持及必要的营养，在维持内环境稳定的过程中起到重要的作用[1]。然而，由脂多糖(lipopolysaccharides，LPS)或活化的小胶质细胞分泌的白细胞介素1α(interleukin 1α，IL-1α)、肿瘤坏死因子α(tumor necrosis factor α，TNF-α)和C1q，能诱导静息星形胶质细胞转变为反应性星形胶质细胞，后者分泌补体C3、Fbln5等一系列蛋白及多种炎症因子，包括IL-1β、IL-6、TNF-α等神经炎症调节因子，使得星形胶质细胞失去正常的功能，并诱导神经元和少突胶质细胞死亡，加重脑神经炎症的发展恶化[2]。因而，对星形胶质细胞的研究或将成为改变炎症进程的新方向。

大黄素(emodin)是大黄的主要有效成分，也是大黄药效物质基础的重要标志物之一。大黄素分子量270.13 u，脂溶性高，有利于穿透血脑屏障，可明显抑制脑组织炎性级联反应，降低TNF-α和IL-1β的表达[3]。据文献报道，大黄素能抑制由LPS诱导的人脐静脉内皮细胞(human umbilical vein endothelial cells，HUVECs)炎症因子(IL-6、IL-1β)和趋化因子(IL-8、CCL2)的表达，降低IκBα的降解和NF-κB活性[4]，这些结果提示大黄素具有抗炎和减少神经细胞凋亡的作用。本课题组前期研究发现，大黄素可促进脑源性神经营养因子(brain-derived neurotrophic factor, BDNF)的表达，显现出一定的神经保护作用[5]。本研究采用大黄素干预LPS诱导的星形胶质细胞，探讨大黄素对LPS诱导星形胶质细胞炎症反应的调节及作用机制。

1 材料

1.1实验动物健康成年的SPF级♀、♂SD大鼠，体质量(280±20)g，购于上海斯莱克实验动物有限公司，合格证号：2015000510392，许可证号：SCXK(沪)2012-0002。于福建中医药大学医学实验动物中心饲养，许可证号：SYXK(闽)2014-0005，适应性喂养1周后合笼交配，取出生24 h内的乳鼠用于实验。

1.2试剂大黄素(上海皇晶生物科技有限公司，纯度≧98%)；LPS(Sigma，货号：L2880)；DMEM/F12(HyClone，货号：SH30023.01)；胎牛血清(Gibco，货号：100099141)；细胞裂解液(碧云天生物技术有限公司，产品编号：P00013B)；ChamTM SYBR®qPCR Master Mix(南京Vazyme公司，批号：1604010)；RNeasy® Mini Kit(德国Qiagen公司，批号：151052173)；逆转录试剂盒(美国Thermo公司，批号:00425005)；胶质纤维酸性蛋白(glial fibrillary acidic protein, GFAP)抗体(货号：ab7260)、荧光二抗(货号：ab150077)，均购自Abcam公司；C3抗体(上海生工，货号：D151005)；早期生长反应因子4(early growth response-4,Egr-4)抗体(Santa Cruz公司，货号：sc-133540)；β-actin抗体(北京全式金生物技术有限公司，批号：k10601)；DAPI染色液(碧云天生物技术有限公司，货号：C1005)；NO测定试剂盒(南京建成生物工程研究所，货号：A012)。

1.3仪器倒置荧光显微镜(德国Leica公司)；7900H荧光定量PCR仪(美国Applied Biosystems公司)；PrimoR高速台式冷冻离心机(美国Thermo Fisher公司)；酶标仪(TECAN公司)；Mini PROTEAN Tetra 小型垂直电泳槽、Mini Trans-Blot小型转印槽、C1000 PCR仪、ChemiDoc XRS+凝胶成像分析系统(美国Bio-Rad公司)。

2 方法

2.1原代星形胶质细胞的分离、培养将出生24 h之内的乳鼠置于75%乙醇中消毒后，使用小剪刀断头，沿囟门剪开颅骨，使其脑组织暴露，弃去小脑，剥去脑膜后取大脑皮层，用0.25%的胰蛋白酶消化10 min，使组织消化为细胞后，接种于用多聚赖氨酸包被的25 cm2培养瓶中，放于37 ℃细胞培养箱内，使用含10%胎牛血清、1% PS的DMEM/F12培养基培养，取材24 h后全量换液，此后每隔3 d，半量换液1次，细胞培养10～14 d左右，可观察到细胞长满瓶底，并出现分层现象：底层细胞充分铺展，接触紧密，多为扁平、具有多个突起的大细胞(星形胶质细胞)，而上层细胞多类圆形、折光性强，边缘有毛刺样突起，附于星形胶质细胞表面生长(以小胶质细胞为主)。参考McCarthy等[6]经典分离胶质细胞的方法，手摇培养瓶3～5 min，使附于星形胶质细胞表面的细胞脱落下来，弃去培养液，即可去除小胶质细胞及其他杂细胞。

2.2原代星形胶质细胞的鉴定以5×107·L-1的密度接种于用多聚赖氨酸包被的24孔板中，24 h后吸去上清液，并用PBS浸洗3遍，而后使用预冷的4%多聚甲醛固定20 min，用PBS洗3次，每次3 min，滴加5%的BSA室温封闭30 min后，用PBS洗3次，加入稀释的一抗(GFAP单克隆抗体1 ∶500)，放于湿盒中孵育过夜；次日，使用PBS洗3次后，滴加适量荧光二抗(1 ∶500)，避光室温孵育2 h，PBS洗3次后，滴加DAPI染料室温染核8 min后，使用PBS洗2次，滴加抗荧光淬灭封片液封片，使用荧光显微镜观察。

2.3实验分组及造模、给药待星形胶质细胞分化成熟后，将其分为正常组、正常给药对照组、模型组、给药组，以3×108·L-1的密度接种于用多聚赖氨酸包被的6孔板中，次日，采用含0%胎牛血清、1% PS的DMEM/F12培养基进行细胞饥饿4 h后，使用含1%胎牛血清、1% PS的DMEM/F12培养基配制的LPS(100 μg·L-1)造模24 h，并给予大黄素(10 μmol·L-1)。

2.4检测细胞上清液NO释放量将细胞上清液适当涡旋后，每组样品吸取100 μL，按照说明书步骤依次加入试剂一、试剂二混匀，37 ℃水浴60 min，而后加入试剂三、试剂四充分涡旋混匀30 s，室温静置10 min，4 000 r·min-1离心10 min，取上清液加入显色剂后混匀，室温静置10 min，使用酶标仪在550 nm处测各样品吸光度值。而后根据公式计算出各样品的NO释放量，计算公式：NO含量/μmol·L-1=(测定OD值-空白OD值)/(标准OD值-空白OD值)×标准品浓度×样品测试前稀释倍数。

2.5实时荧光定量PCR检测星形胶质细胞CD14、C3mRNA表达按照Qiagen RNeasy® Mini Kit试剂盒，提取总RNA，测定RNA的纯度及浓度，以A260/A280值达到1.8～2.0为合格，表明无RNA或蛋白质污染。依照试剂盒说明书，使用RT逆转录试剂盒,将RNA逆转录成cDNA，以cDNA为模板，通过荧光定量PCR技术扩增，检测CD14、C3的表达。PCR引物由上海铂尚生物技术有限公司合成，大鼠CD14的上游引物：5′-TGGGCAACAACG GATACCTG-3′，下游引物：5′-GAACTTGGAGGGTCG GGAAT-3′；C3的上游引物：5′-AAAATGGAATCTCT ACGAAGGTCA-3′，下游引物：5′-AGTCGCAGGTCA ATGAAGAAGTC-3′。以GAPDH为内参，校正每个样品的Ct值(每个反应管内的荧光信号到达设定的阈值时所经历的循环数)，以2-△△Ct法对基因表达进行定量分析。

2.6Westernblot法检测星形胶质细胞C3、Egr-4蛋白表达用含1% PMSF的细胞裂解液提取总蛋白，SDS-PAGE电泳，转膜，用封闭液封闭2 h后，加入稀释的一抗(C3单克隆抗体1 ∶500，Egr-4单克隆抗体1 ∶100)，4 ℃孵育过夜，次日用TBST洗3遍，每遍10 min，加入1 ∶3 000稀释HRP标记的二抗，室温下孵育2 h后，TBST洗3遍，每遍10 min，而后加入ECL显色剂，经凝胶成像分析系统检测，以β-actin为内参，用目标蛋白与β-actin的灰度值比值进行各组之间的差异统计。

3 结果

3.1原代星形胶质细胞的免疫荧光鉴定GFAP是星形胶质细胞的标记物，故采用荧光标记GFAP对原代星形胶质细胞进行鉴定。由Fig 1可见，所分离的星形胶质细胞生长状态良好，呈星状，从胞体发出许多长而分支的突起。通过GFAP/DAPI的百分比计算可得，星形胶质细胞的纯度达97%。

Fig 1 Immunofluorescence identification using

3.2大黄素对星形胶质细胞NO释放量的影响为确保LPS模型建立成功，采用NO试剂盒检测星形胶质细胞上清液中NO的释放量。Fig 2结果表明，经LPS诱导24 h后，星形胶质细胞NO释放量增加；大黄素给药后，NO释放量降低，且差异具有显著性(P<0.01)。表明LPS诱导的炎症模型建立成功，大黄素显示出明显的抗炎作用。

Fig 2 Effect of emodin on NO content of astrocytes

##P<0.01vscontrol;**P<0.01vsLPS

3.3大黄素对星形胶质细胞CD14、C3mRNA表达的影响Fig 3结果表明，经LPS诱导的星形胶质细胞CD14、C3 mRNA表达量升高，大黄素干预后，CD14、C3 mRNA表达量降低，且差异具有显著性(P<0.01或P<0.05)。

Fig 3 Effect of emodin on CD14(A)and C3 (B)mRNA

##P<0.01vscontrol;*P<0.05,**P<0.01vsLPS

3.4大黄素对星形胶质细胞C3蛋白表达的影响Fig 4结果表明，经LPS诱导的星形胶质细胞C3蛋白表达量升高，大黄素干预后，C3 蛋白表达量降低，且差异具有显著性(P<0.05)。表明经LPS诱导后，星形胶质细胞由静息转化为反应性星形胶质细胞，表达C3这一指标蛋白。

3.5大黄素对星形胶质细胞Egr-4蛋白表达的影响Fig 5结果表明，经LPS诱导的星形胶质细胞Egr-4蛋白表达量升高，大黄素干预后，Egr-4蛋白表达量降低，且差异具有显著性(P<0.01)。

4 讨论

内毒素作为革兰阴性杆菌细胞壁外层的结构成分，是一种广泛存在于自然界中的致病原，其主要的致病成分为LPS。CD14在介导跨膜信号转导过程中承担识别LPS的作用[7]，是LPS的受体。

Fig 4 Effect of emodin on C3 protein expression

#P<0.05vscontrol;*P<0.05vsLPS

Fig 5 Effect of emodin on Egr-4 protein expression

##P<0.01vscontrol;**P<0.01vsLPS

LPS结合于细胞后，通过LPS-脂多糖结合蛋白(lipopolysaccharide binding protein，LBP)-CD14三联复合物作用于Toll样受体4(Toll-like receptor 4，TLR4)，激活NF-κB和MAPKs信号通路，诱导细胞释放大量细胞因子和炎性介质，如NO、IL-6、TNF-α等[8-9]，导致炎症的发生或进一步加重。本实验研究发现，经LPS诱导后，星形胶质细胞大量释放NO，CD14 mRNA表达量明显上调，而经大黄素干预后，NO释放量减少，CD14 mRNA表达量明显下降。说明大黄素对LPS诱导的星形胶质细胞有较好的抗炎作用，其抗炎机制可能与下调CD14表达，阻断内毒素信号转导通路有关。

补体系统通过直接溶解细胞、细菌及病毒，发挥调理作用及引起机体炎症反应参与宿主早期抗感染免疫；通过清除免疫复合物及凋亡细胞，同时与凝血、纤溶及激肽系统等相互作用，维持机体稳态[10]。激活补体系统的途径主要有经典途径、旁路途经和凝集素途径，而C3是这三大途径的枢纽分子，是补体系统的核心，C3的活化是放大补体级联反应的关键步骤，在不同条件下激活三大途径后形成C3转化酶，裂解C3分子形成C3a和C3b，从而产生炎症[11]。本实验结果显示，星形胶质细胞C3的mRNA和蛋白表达量在LPS诱导后明显增加，而经大黄素干预后，C3表达量明显下调，说明大黄素的作用机制可能与调控以C3为核心的补体系统有关。

Egrs为早期生长反应因子，包括Egr-1、Egr-2、Egr-3、Egr-4，与神经系统联系密切。该基因家族成员在C端均有1个由3个锌指单位构成的DNA结合区域，这也是Egr基因家族在功能上具有相似性的原因，而其中Egr-4与Egr-1的氨基酸序列更是达到了83%的同源性，功能最为相似。目前已有报道，Egr-4结合NFAT或NF-κB可以增强下游炎症因子的转录[12-13]。另一方面，在大脑中动脉闭塞模型大鼠中，上调Egr-4的表达有减轻炎症，保护神经细胞的作用[14]，提示Egr-4具有双向调节功能。总的来说，针对Egr-4生物学功能及其对下游基因的转录调控研究尚少，但大量研究发现，与Egr-4高度同源的Egr-1在各类炎症相关性疾病的发生、发展中有直接或间接的参与，不但使细胞从静息期进入增殖期，调节细胞生长与分化，还通过各类细胞因子，如细胞间黏附分子1、血管细胞间黏附分子1、IL-1β、TNF-α等，诱发炎性蛋白的表达，启动炎症的发生[15]。本实验结果表明，星形胶质细胞在LPS诱导后Egr-4蛋白表达升高，因此，我们猜测Egr-4在LPS诱导星形胶质细胞这一模型中，与Egr-1相似，在炎症反应中表达上调，具有促炎作用，可能通过与LPS-LBP-CD14三联复合物作用于TLR4后所激活的NF-κB结合，调控下游炎性因子的转录，参与炎症的发生与发展，而大黄素通过下调Egr-4的表达，抑制转录过程，从而发挥抗炎作用。同时，有文献报道，C3与Egr-4存在一定的上下游间的联系[14]，但在此模型中有待进一步研究。

综上所述，大黄素对LPS诱导星形胶质细胞炎症反应的保护作用可能与阻断内毒素信号转导通路，调控C3与Egr-4，从而减轻炎症有关。