microRNAs调控胃癌相关基因的研究进展

2018-11-12路玉盼董宪喆

中国药理学通报 2018年11期

路玉盼,董宪喆,王瑾,刘屏

(1. 中国人民解放军总医院临床药理研究室,北京 100853；2. 山西中医学院中药学院,山西晋中 030600)

胃癌(gastric cancer，GC)是世界范围内最常见的恶性肿瘤之一，在东亚尤其高发，据世界卫生组织统计，东亚胃癌发病率和死亡率分别位居世界第2和第3，其中中国占有较大的比例。我国胃癌的死亡率超过世界平均水平的两倍，其高死亡率主要是由于早期诊断困难和缺乏有效的干预手段，将近2/3胃癌患者确诊时已处于晚期，并伴有瘤转移，提高胃癌的诊疗水平，是临床研究者所面临的重大挑战[1-2]。迄今为止，胃癌的发病机制仍不明确，但大量研究表明，其发生和侵袭转移是一个多基因及相关分子共同参与的过程，涉及多种相关癌基因、抑癌基因、信号通路的关键蛋白等。目前，研究较为明确的胃癌相关基因主要有表皮生长因子受体2(human epidermal growth factor receptor 2，Her-2)、PTEN、人类端粒酶逆转录酶(telomerase reverse transcriptase，hTERT)、Bcl-2、c-myc等。

微小RNAs (microRNAs，miRNAs) 是一类内源性非编码单链RNAs，可与靶mRNA 3’-非翻译区(3’-untranslated regions，3’-UTR)互补配对，导致mRNA 降解或抑制其翻译，发挥调控基因表达的作用。miRNAs可通过调控细胞增殖、分化、存活、代谢、基因组稳定性、炎症、侵袭等生理过程，影响肿瘤的发展。在关于人类癌症的报道中，其表达水平经常是失调的，扮演着癌基因或抑癌基因的角色[3]。在恶性转移性肿瘤中，miRNAs的表达普遍下调，使肿瘤细胞转移和侵袭相关的趋化因子、受体等蛋白的表达升高、功能增强，促进了肿瘤的发生发展[4]。miRNAs有望单独或联合作为肿瘤的诊断标志物和治疗靶点[5]，为寻找更有效的肿瘤诊治手段提供了全新视角。现将近年miRNAs通过调控与胃癌相关基因及蛋白Her-2、PTEN等的表达，参与胃癌发生发展的进展进行综述，旨在为进一步寻找胃癌更为特异、灵敏的诊断标志物和治疗靶点，奠定理论基础。

1 miRNAs对胃癌相关基因及蛋白的调控作用

1.1miRNAs对Her-2的调控作用Her-2基因是原癌基因，可编码酪氨酸激酶受体，Her-2的活化可诱导胃癌细胞浸润性生长，促进细胞增殖、分化、转移、侵袭、血管再生等，在胃癌的发生、发展中起关键作用。EGF/Her-2轴在包括胃癌在内的多种肿瘤中均处于激活状态，与侵袭性表型和预后不良息息相关[6]。

Liu等[6]发现，胃癌组织中miR-133水平的下调会促进癌细胞生长，进一步机制研究，在人胃癌细胞AGS 的Her-2基因3’-UTR植入荧光素酶报告基因质粒，然后通过转染miR-133的模拟物和反义寡核苷酸，观察miR-133对Her-2表达的影响，结果显示：miR-133模拟物可降低Her-2基因表达，而miR-133反义寡核苷酸可升高细胞内Her-2基因水平；同时，过表达miR-133可抑制细胞增殖、促进凋亡，抑制miR-133表达可促进细胞生长、抑制凋亡，说明Her-2基因是miR-133的靶基因。其他学者采用类似的方法，发现Her-2高表达、miR-331-3p低表达与晚期胃癌紧密相关，高水平HOTAIR通过结合 miR-331-3p 3’-UTR，间接解除了miR-331-3p对Her-2的抑制作用，参与了胃癌的发生发展[7]。Fassan等[8]在涵盖了胃癌和食道腺癌完整组织学谱的90例活检样本中，发现miR-125a-5p和 miR-125b明显低表达，Her-2的表达与miR-125表达呈负相关。PCR实验进一步证实，Her-2低表达和Her-2高表达的胃癌和食道腺癌样本中，miR-125a-5p和miR-125b仍与Her-2的表达呈明显负相关，与前述结果一致。说明miR-125a-5p和miR-125b可调控Her-2的表达，Her-2为miR-125的靶基因。miRNAs通过调控癌基因Her-2的表达，参与了胃癌进展，提示我们可以通过检测相应miRNAs水平或调整其水平，为胃癌诊断和治疗提供参考依据。上述研究虽显示在肿瘤形成级联反应中，癌基因Her-2表达是失调的，但导致Her-2蛋白上调的机制仍不清楚，需要更多的深入研究[8]。

1.2miRNAs对PTEN的调控作用定位于人类染色体10q23的PTEN 是具有磷酸酶活性的抑癌基因，能够抑制肿瘤细胞增殖、转移和浸润，还可通过调控相关信号通路，参与血管生成，该基因的突变失活与人类多种恶性肿瘤的发生、发展密切相关。近期研究表明，PTEN在人类胃癌中是低表达或不表达的，其低表达能够使胃癌患者对多种化疗药物产生抗性[9-10]。

miR-214被发现在胃癌组织和细胞株中过表达，且miR-214的表达水平与胃癌的进展以及预后不良紧密相关。同时，在肿瘤组织中，miR-214水平和PTEN的表达呈明显负相关，即miR-214通过靶向PTEN基因的3’-UTR，在转录后水平负向调控PTEN的表达。PTEN与癌细胞的转移和浸润等密切相关，所以推测miR-214可通过抑制PTEN的表达，参与胃癌的发生、发展[9]。依赖于炎症因子IL-1β激活的核因子NF-κB，可以促进miR-425的上调，上调的miR-425再通过靶向PTEN，来促进胃癌细胞的生长[11]。Shi等[12]在胃癌细胞和肿瘤样本中发现，miR-221-3p明显高表达，进一步机制研究揭示，miR-221-3p可能是通过抑制靶基因PTEN的表达，发挥致瘤特性。

Wang等[10]对miR-19a/b在耐药胃癌细胞株中的作用机制进行了研究，发现miR-19a/b表达的上调，可降低胃癌细胞对化疗药物阿霉素的敏感性。机制研究发现，miR-19a/b除了可以通过上调MDR1和P-gp蛋白的水平，加速胃癌细胞中阿霉素的主动外排，同时可通过调控Bcl-2和Bax的表达，来拮抗药物诱导的细胞凋亡作用。Western blot结果显示，在转染miR-19a/b的SGC-7901细胞中，PTEN表达下调，Akt表达上升，提示miR-19a/b可通过调节PTEN-Akt信号通路，增加药物的排出，降低细胞对药物的敏感性。研究最终证实了PTEN是miR-19a/b功能性的靶标，miR-19a/b可抑制PTEN的表达，参与胃癌多药耐药性的形成。此外，还有其他研究发现多个miRNAs可通过直接靶向PTEN，调控PTEN的表达，在胃癌耐药等方面发挥重要作用。如Yang等[13]证实了miR-21通过调控PTEN的表达，使胃癌患者对顺铂治疗抗性增强。因此，PTEN 基因的生物治疗将会为耐药的肿瘤患者带来福音，可能为肿瘤的治疗提供新的途径。

1.3miRNAs对hTERT的调控作用hTERT决定了端粒酶的活性，能够逆转端粒缩短。当正常增殖的细胞进入凋亡和坏死阶段时，hTERT表达会逐渐降低，此时细胞停止增殖。然而，高表达的hTERT以及端粒酶的激活都会导致肿瘤细胞无限增殖。hTERT在肿瘤形成、癌细胞生长、转移和浸润方面发挥了重要作用[14]。

Zhang等[15]发现，miR-1182通过结合hTERT基因的开放阅读框，调控hTERT的表达，进而抑制了胃癌细胞的增殖和转移。尚有miR-1207-5p 和 miR-1266通过直接结合于靶基因hTERT 3’-UTR,抑制了胃癌细胞的生长和浸润的相关研究[14]。竞争性内源RNAs(competing endogenous RNAs，ceRNAs)是一种全新的基因表达调控模式，是RNAs的一种作用方式。细胞内存在一类内源性RNAs，由于3’-UTR含有与miRNA靶mRNA 3’-UTR相似的miRNAs反应原件(miRNAs response elements，MREs)，可以竞争性结合相同的miRNAs，进而调节各自的表达水平[1]。Lü等[16]近期研究结果表明，长链非编码RNA BC032469作为竞争性内源RNA，竞争结合miR-1207-5p，从而消除了miR-1207-5p对靶基因hTERT的抑制作用，促进了胃癌细胞增殖。

1.4miRNAs对Bcl-2的调控作用Bcl-2家族蛋白是一类凋亡进程的重要调节因子，可调控细胞色素C释放及caspases级联反应，最终影响凋亡发生。Bcl-2蛋白作为细胞凋亡的抑制基因，在caspases级联放大与线粒体之间扮演着“桥梁”的作用。在多种人源肿瘤细胞株中可观察到 Bcl-2过表达，而在分化细胞或将凋亡细胞中表达量很低或不表达。

Zhu等[17]研究了胃癌样本中miR-429和抗凋亡蛋白Bcl-2的水平，并分析了二者表达水平的相关性。结果显示，与癌旁组织相比，miR-429水平在胃癌样本中明显降低，Bcl-2蛋白水平明显升高，两者呈明显的负相关，进一步的荧光素酶报告基因法显示，miR-429调控了Bcl-2的表达。此外，下调miR-429可阻断5-氟尿嘧啶(5-FU)处理导致的胃癌细胞AGS活力下降和凋亡增加，而上调miR-429可与5-FU的抗肿瘤作用产生协同效应。由此我们推测，过表达miR-429可作为胃癌的潜在治疗靶标，通过增加其表达可辅助化疗药物诱导细胞凋亡。有研究报道[18]，miR-449a 通过抑制靶基因Bcl-2的表达，促进人类胃癌细胞株MGC-803和SGC-7901凋亡。

Sacconi等[19]发现，miR-204在胃癌和癌旁组织样本中表达水平存在明显差异，进一步研究发现，miR-204靶向抑制Bcl-2 mRNA的表达，可以增强胃癌细胞对顺铂和奥沙利铂等抗癌药物的反应性；miR-204异位表达可抑制细胞集落形成、迁移和浸润。最新研究显示[20]，胃癌细胞SGC-7901中，miR-449a表达水平明显低于正常的胃上皮细胞GES-1，同样，miR-449a在胃癌组织中的表达也明显低于癌旁组织。MTT实验结果表明，上调miR-449a水平抑制了SGC-7901细胞的增殖；流式细胞术检测发现，miR-449a异位表达可降低S期细胞百分率，同时增加G1/G0期细胞比率，并与顺铂诱导的胃癌细胞凋亡作用相协同；进一步的机制研究表明，miR-449a可能是通过抑制Bcl-2和cyclin D1表达，在胃癌中发挥抑癌作用，同时增强胃癌对化疗的敏感性。miRNAs对癌基因Bcl-2表达的抑制作用，提示我们可以从调节miRNAs表达角度来考虑对胃癌的防治策略。除上述miRNAs之外，Bcl-2还可以受到miR-190b等多种miRNAs的转录后调控，影响细胞凋亡，在胃癌细胞化疗抗性形成过程中发挥重要作用。

1.5miRNAs对c-myc的调控作用c-myc作为一种癌基因，广泛参与了细胞迁移、生长、增殖等多个生理过程，在人类多种肿瘤中过表达。最新研究显示，c-myc在胃癌进展中发挥着促癌作用，其过表达与胃癌晚期、淋巴结转移、低存活率紧密相关[21]。

miR-155被发现在胃癌组织和胃癌细胞株SGC-7901中明显低表达，而高水平的miR-155可明显抑制肿瘤细胞的活力、增殖以及黏附。进一步研究显示，miR-155可通过直接结合c-myc基因的3’-UTR，抑制其表达，在胃癌进程中发挥一定作用[22]。Qian等[21]采用生物信息学分析手段，预测c-myc可能是miR-561的靶基因，采用荧光素酶报告基因法进一步验证，结果显示miR-561通过直接结合c-myc 3’-UTR，抑制其表达；恢复c-myc在胃癌细胞中的表达，会扭转miR-561对其表达的抑制作用。miR-561通过抑制靶标c-myc的表达，抑制了胃癌细胞的增殖和浸润，说明miR-561有作为肿瘤抑制因子的潜质。基因上游CpG岛高甲基化常常导致抑癌miRNAs下调，Yin等[23]在miR-33b低表达的胃癌细胞中，采用甲基化特异性PCR(methylation-specific PCR，MS-PCR)，发现miR-33b基因上游的CpG岛甲基化水平有所升高。进一步通过转染、免疫印迹等方法发现，抑癌miR-33b和c-myc在胃癌细胞和样本中表达呈负相关，研究结果表明miR-33b可能是通过靶标c-myc的表达，抑制了肿瘤的转移、浸润和增殖。研究表明[2]，let-7b也可通过下调c-myc，增强顺铂和长春新碱耐药的SGC-7901对化疗药物的敏感性。

1.6其他除了前述公认的参与胃癌发生发展进程基因外，miRNAs还可通过调控其他基因的表达，参与胃癌发生、发展以及肿瘤对化疗药物的多药耐药。miR-139通过调控靶基因C-X-C 趋化因子受体4(CXCR4)的表达，参与Her-2信号通路，促进胃癌进展和转移[4]。在研究miR-219-2-3p对胃癌抑癌机制时，金锦莲等[24]发现，胃癌细胞株中miR-219-2-3p可能是通过下调ERK信号通路的活性，从而产生对胃癌细胞的抑制作用。膜受体配体JAG1在多种肿瘤中高表达，且与预后存活率低密切相关。韦尉元等[25]在预测 miR-1284可能的下游靶基因的基础上，进一步探讨了miR-1284与胃癌的相关性及分子机制，结果显示，miR-1284可能通过调控靶基因 JAG1，发挥抑制胃癌发生、发展的作用。

2 小结

虽然近年来胃癌诊断方法和外科治疗技术不断提高，但晚期胃癌患者的预后仍不理想。因此，探寻特异、灵敏的生物学标志物，尽早明确诊断和选择治疗方式，对于提高胃癌患者的生存率具有重要意义。近期研究较热的非编码miRNAs在许多疾病和癌症中表达失调，失调的miRNAs会影响大多数的癌症特征，具体了解miRNAs是如何影响癌症相关生物过程，其定量分析会对癌症的诊断、治疗和预后有很大参考价值。未来能将miRNAs用于胃癌诊断标志物和治疗靶点不失为一个好方向。

目前对miRNAs作为诊断标志物的研究尚处于探索阶段，所检测到的病例数有限，文中提及可能参与胃癌发生机制的miRNAs(Fig 1)指标是否是胃癌所特异的？尤其在不同分期胃癌患者体内表达，是否具有临床参考价值？这些问题的解决尚需投入更多的临床研究。目前，已有关于多个miRNAs联合起来组成的miRNAs循环分子标记物表达谱在结肠癌诊断方面的研究[4]。相信随着对miRNAs 研究不断深入，miRNAs单独或联合作为肿瘤诊治评估的重要指标，在未来有望应用于临床。