新生猪缺氧缺血性脑损伤后基底节区Tau蛋白与谷氨酸变化的相关研究

郑 阳，王晓明

（中国医科大学附属盛京医院放射科，辽宁 沈阳 110004）

微管是脑内的细胞骨架成分，主要由微管蛋白及微管相关蛋白组成，微管影响脑组织细胞多种功能。Tau蛋白是脑内含量最多的微管相关蛋白，神经系统内主要在少突胶质细胞中广泛表达。脑组织内Tau蛋白的作用主要是与微管蛋白结合，促进微管形成，同时能够维持微管的稳定性[1]。Tau蛋白异常磷酸化可导致其丧失正常的生理功能，异常过度磷酸化后与微管蛋白的结合能力仅是正常蛋白结合能力的1/10，失去维持微管稳定性的作用，致使受累微管结构破坏，正常轴突转运障碍[2]。Wen等证实[3]缺氧缺血（Hypoxic ischemia，HI）后，神经元中 Tau蛋白过度磷酸化与细胞凋亡关系密切。由于谷氨酸（Glutamate，Glu）是脑内含量较多的兴奋性氨基酸，参与脑内能量代谢的调节，本研究采用新生猪HI模型研究HI后脑组织内Tau蛋白及Glu的变化，揭示HI后Tau蛋白及Glu变化的相关性。

1 材料与方法

1．1 实验动物

选用新生约克夏猪45只，3～5 d日龄，体质量1～1．5 kg，性别雄性（为尽量减少性别带来的个体差异）。所有动物模型制备过程执行《实验动物管理条例》和《实验动物许可证管理办法》规定的标准。随机分配到对照组（n=9）及模型组（n=36）。模型组根据HI后MR扫描时间段又进一步分成6个亚组（0～2 h，n=4；2～6 h，n=5；6～12 h，n=6；12～24 h，n=5；24～48 h，n=7；48～72h，n=9）。 本研究获得中国医科大学动物实验伦理委员会批准（伦理批号为：2015PS337K）。

1．2 实验模型制作

1．2．1 对照组

室温保持在28～30℃，臀部肌肉注射速眠新（0．6 mL/kg）麻醉新生猪。麻醉过程中密切观察动物的生命体征，一旦发现动物陷入昏迷并且伴有肌肉松弛、四肢肌张力减低及角膜反射迟钝，立即将新生猪以仰卧位固定在操作台上实施手术。首先，在喉镜引导下对新生猪实施气管插管 （φ2．5 mm），连接TKR－200C小动物呼吸机进行机械通气，通入100%氧气，呼吸机通气参数值被设置为呼吸比 （1/E）1∶1．5，呼吸频率30次/min。应用 TuffSat手掌式脉搏血氧仪（美国GE公司）监测心率和血氧饱和度。在对切口部位及周围皮肤进行消毒后，颈正中切口，将双侧颈总动脉及毗邻的颈内静脉与迷走神经分离开来，留置5．0 mm丝线。对照组仅进行手术，不进行HI过程。

1．2．2 HI模型组

模型组新生猪进行上述相同过程，待动物状态稳定30 min后，用小动脉夹夹闭双侧颈总动脉，阻断双侧颈动脉血流，同时机械通入6%含氧混合气，持续40 min。然后停止HI过程，撤去动脉夹，恢复双侧颈动脉血流，重新机械通入100%氧气，缝合切口。建模过程中注意对新生猪生命状态进行监控。同时若术中及术后发生休克及抽搐应及时处理[4－5]。术后，将动物转移至恒温箱（37℃）内，以保持术后恢复期间动物体温维持在正常范围内。自主呼吸恢复后停用呼吸机。注意在MR扫描时应保持体温，避免温度波动给实验结果带来偏差。MR成像时对未恢复自主呼吸的采用人工抱球法维持呼吸[4，6－7]。

1．3 1H－MRS 扫描及数据处理

采 用 Philips 3．0T MRI （Achieva 3．0T TX；Philips Healthcare Systems，Best，the Netherlands）进行扫描，笔形束，二阶匀场。体线圈发射，八通道头线圈（Sense）接收。MRS采用单体素长TE扫描：TR/TE=2 000 ms/144 ms，NSA=64，VOI=10 mm×10 mm×10 mm。 感兴趣区（Regions of interest，ROI）选择右侧基底节（图1）。每只新生猪在HI后按分组中规定的各时间点进行MR扫描。扫描获得的波谱数据通过 （Linear combination of Model in vitro spectra,LcModel）进行后处理（NAA 位于 2．02 ppm，Cr位于3．02 ppm，Cho 位于 3．2 ppm，Lac 位于 1．33 ppm，Tau包含两组波峰，分别位于3．25ppm及3．42ppm附近）。

图1 1H－MRS成像ROI的定义。采用T2WI图像横断位进行ROI选择，右侧基底节区作为1H－MRS ROI。Figure 1. Definition of ROIs in 1H－MRS．Illustration of the ROI in MRS scanning．For all animals,the right basal ganglion is selected as the ROI(T2WI image served as reference for the selection of ROIs in this study)．

1．4 统计分析

采用SPSS软件进行统计学处理，计量资料用均数±标准差（x±s）表示。采用ANOVA方差分析比较对照组及HI模型组各个时间点的基底节区Tau蛋白含量及Glu含量的表达是否存在统计学差异；采用Spearman相关分析对Tau蛋白含量及Glu含量进行相关性分析，其中P＜0．05为差异具有统计学意义。

2 结果

2．1 基底节区Tau蛋白含量

HI再灌注后，各时间点Tau蛋白含量均值呈现先升高后降低的趋势，在24～48 h达到最高值，均值在48～72 h随时间稍有下降（图2）。除0～2 h组Tau蛋白含量与对照组无统计学差异外（P=0．243），其余各组与对照组比较均有统计学差异 （P＜0．05）。Tau蛋白含量最高点24～48 h组除与48～72 h无统计学差异外，与对照组及模型组其余各时间点均有统计学差异（P＜0．05）。

图2 对照组及模型组基底节区Tau蛋白表达随时间变化趋势。Figure 2. Tau content changes in basal ganglia within control group and HI group．

对照组及HI模型组部分时间点1H－MRS扫描数据经Lcmodel拟合曲线如图3所示。

2．2 基底节区Glu含量

HI再灌注后，Glu含量呈现先上升后降低的趋势，继而又上升，即“双峰”样变化，在 6～12 h、24～48 h达到峰值后的12～24 h及48～72 h随时间稍有下降（图 4）。 6～12 h、24～48 h 两次峰值与对照组均存在统计学差异（P＜0．05）。模型组中各时间点Glu含量与对照组比较均有统计学差异（P＜0．05）。

2．3 HI后基底节区Tau与Glu变化的相关性

HI后，基底节区Tau蛋白含量与Glu含量随时间变化成正相关，相关系数为 0．76（P=0．00）（图 5）。

图3 对照组及模型组部分时间点内Tau蛋白1H－MRS（经LcModel软件处理）结果。图3a～3d分别为对照组及HI后16 h、35 h、68 h右侧基底节1H－MRS的谱线（圈内所示为Tau峰，位于3．25 ppm及3．42 ppm附近）。HI后16 h、35 h Tau峰升高，68 h可见Tau峰稍下降。Tau蛋白含量分别为 0 mmol/kg、0．68 mmol/kg、2．58 mmol/kg、1．997 mmol/kg。Figure 3. Results of Tau content and1H－MRS data at selected time points sample data analyzed by LCModel in control and study group．Figures 3a～3d are the1H－MRS spectral curves of the right basal ganglion analyzed by LCModel in the control group and the HI group at 16 h,35 h and 68 h,respectively．At 16 h and 35 h after HI insult,the Tau peaks(3．25 ppm,3．42 ppm)are markedly elevated;at 68 h,the Tau peak is lower than 35 h group．Tau concentration are 0 mmol/kg,0．68 mmol/kg,2．58 mmol/kg,1．997 mmol/kg respectively．

3 讨论

新生儿出生后脑组织发育主要包括神经细胞的增殖及髓鞘形成。Kreis等[8]发现，不同孕龄正常新生儿脑内不同部位Tau含量不同，同时Huppi等[9]也证实足月儿及早产儿脑内Tau蛋白水平不同，但是二者Tau蛋白的含量均随着年龄增长逐渐上升至成人水平。

图4 对照组及HI模型组基底节区Glu含量随时间变化趋势（横线表示均值）。在HI后Glu首先出现上升，于6～12 h及24～48 h两次达到高峰，继而逐渐下降。Figure 4. Glu changes in basal ganglia within control group and HIBI group．The Glu peak increases 6～12 h,24～48 h after HI．The level of Glu gradually decreased．

图5 HI后Tau含量与Glu含量变化的相关性。图5a为Tau蛋白含量与Glu含量在HI后不同时间段内随时间变化的趋势（各点表示均值；左侧Y轴及黄线表示Tau含量，右侧Y轴及粉线表示Glu含量）；图5b为HI后Tau蛋白含量与Glu呈线性正相关，Spearman 相关系数为 0．76。Figure 5.Correlation of changes in content of Tau and Glu after HI．Figure 5a:The mean value of time varying between Tau and Glu in different time periods after HI(Each point represents the mean value．The left Y－axis and yellow line indicate the content of Tau,and the right Y－axis and pink line indicate Glu content)．Figure 5b:After HI,there is a positive linear correlation between Tau and Glu,and the correlation coefficient of Spearman is 0．76．

Glu为脑内含量较多的兴奋性神经递质，在突触信号传递过程中发挥着重要作用[10－12]。生理情况下，Glu参与调控发育脑中少突胶质细胞前体细胞的形态分化，是髓鞘发育的必要条件[13]。Tau蛋白是脑内含量最多的微管相关蛋白（Microtubule－associated proteins，MAPs），生理功能是促进微管形成及稳定微管[14－15]。Tau蛋白含量的病理性表达及异常磷酸化是HI后影响髓鞘化的重要因素。

研究证实，Glu代谢障碍可导致Tau蛋白出现异常过度磷酸化及神经毒作用[16－18]。由于HI后，小胶质细胞释放大量Glu，并激活少突胶质细胞前体细胞上的海人藻酸受体（KAR）和α－氨基－3羟基－5甲基－4异恶唑受体（AMPARS），介导少突胶质细胞前体细胞内Ca2+超载，此外，还可以激活星形胶质细胞上的 N－甲基－D－天门冬氨酸（N－methyl－d－aspartic acid receptor，NMDAR），使临近的少突胶质细胞由NMDAR介导的兴奋性Ca2+通路激活，导致Ca2+超载，介导少突胶质细胞坏死，Glu的兴奋性毒作用是少突胶质细胞及少突胶质细胞前体细胞死亡的重要机制[19－20]。在HI条件下，无氧酵解可引起乳酸中毒，这种缺氧状态会直接导致神经元坏死[21]。神经元损伤后，Tau蛋白可从神经元胞体释放，可从微管上脱落，因此，受损细胞数量越多、损伤程度越重，Tau蛋白释放就越多，游离的Tau蛋白也越多，引起脑组织中 Tau蛋白含量升高[22－23]，由此可见，Tau蛋白含量可反映神经系统的损伤程度。

通过本研究结果可见，HI后，Glu及Tau蛋白均呈现先增高后降低的趋势，Glu及Tau蛋白呈显著正相关（r=0．76）。HI后，Glu 浓度升高，Tau 蛋白释放增加，Glu与Tau蛋白具有共同作用，过度磷酸化的Tau蛋白可引起线粒体功能障碍，同时可引起兴奋性氨基酸转运体功能受损，Glu在突触部位的清除能力降低并逆向转运，导致细胞外Glu大量聚集。

有研究表明，HI大鼠脑内皮质和脑室周围白质的神经细胞凋亡数量与Tau蛋白表达水平呈正相关[24]，其可能的机制是HI后神经细胞死亡释放了Tau蛋白所致。而微管结构的破坏会导致神经元细胞体与神经纤维之间的物质传递障碍，从而造成神经细胞的坏死与凋亡及神经纤维的变性。

本研究中，HI后12～24 h，Glu浓度有个短暂的低峰，这是因为此时负责将胞外Glu重新摄取回到星形胶质细胞胞内的谷氨酸转运体的作用，将多余的 Glu 转化为谷氨酰胺（Gln），并通过“Glu（in neuron）－Gln（in astrocyte）”循环返回神经元[25]，继而又升高可能是由于再灌注损伤引起细胞破裂导致Glu释放增加所致[26]。

本研究发现Tau蛋白升高后继而稍微降低，与Franz等[27]观察到的脑损伤后Tau蛋白先升高后降低的趋势相似，这可能是由于长时间HI，导致脑组织细胞死亡数量增加，Tau合成减少以及分解增加所致。

本研究选择基底节作为ROI，采用1H－MRS成像结合Lcmodel软件处理，分析HI后Tau蛋白含量及Glu含量的变化的相关性，发现二者的变化呈正相关，HI后共同调节脑内病理生理变化，分析了HI再灌注后神经网络的调节机制，为进一步研究打下基础。