脱氢表雄酮联合高脂饮食诱导大鼠多囊卵巢综合征模型的研究

刘洪祥，赵彦楠，霍佳宁，李达，马晓欣

（中国医科大学附属盛京医院妇产科，沈阳 110004）

多囊卵巢综合症 （polycystic ovary syndrome，PCOS） 是引起育龄期女性内分泌失调及不孕的最重要原因，影响约5%～10%的育龄期女性［1-4］。尽快明确PCOS的发生、发展机制是进一步治疗的基础。由于在临床上获取多囊卵巢标本较为困难，限制了对该疾病发生、发展机制的基础研究，因此建立多囊卵巢动物模型对PCOS发病原因的研究以及指导临床的诊治有深远意义。鹿特丹专家会议推荐的多囊卵巢的诊断标准： （1） 稀发排卵或无排卵； （2） 高雄激素的临床表现和 （或） 高雄激素血症； （3） 卵巢多囊性改变。符合上述3项中的2项即可诊断为PCOS。大多数模型具有卵巢多囊的形态改变，但理想的动物模型还应有稀发排卵和高雄血症的特点。PCOS的建模方法很多，但尚无一种能满足所有诊断标准的标准建模方法。本研究采用脱氢表雄酮 （dehydroepiandrosterone，DHEA） 皮下注射联合高脂饮食 （high fat diet，HFD） 建模，探究更理想的PCOS大鼠的造模方法。

1 材料与方法

1.1 实验动物及饲养条件

选取21日龄清洁级雌性SD大鼠80只，随机分为3组：对照组（n= 30）、实验组（n= 30）和HFD组（n= 20）。实验动物于中国医科大学本溪动物实验中心SPF级饲养，自由饮水、自由进食。饲养温度为20～24 ℃，饲养环境湿度为40%～60%，每日光照及黑暗时间各12 h。

1.2 构建动物模型

所有实验动物分组后适应性喂养3 d。将 DHEA［60 mg/ （kg·d）］溶于 0.2 mL 注射用油中［5-6］。对照组大鼠颈背部皮肤皮下注射0.2 mL 注射用油，实验组大鼠颈背部皮肤皮下注射 DHEA+注射用油0.2 mL，HFD组颈背部皮肤皮下注射 DHEA+注射用油0.2 mL，同时喂以高脂饲料。

1.3 大鼠体质量监测

测量大鼠体质量并记录数值 （3 d/次） ，监测大鼠体质量变化。3组大鼠在造模的第8周末晚禁食水，次日晨测量体质量。

1.4 大鼠血清激素水平测定

喂养8周后取材，取材前禁食水12 h。10%水合氯醛麻醉后腹主动脉取血，-4 ℃离心后取血清分装于EP管，-80 ℃冻存。应用放射免疫法测定睾酮水平。

1.5 大鼠卵巢质量测定及组织学检查

解剖双侧卵巢，去除卵巢表面的脂肪组织及其覆盖包膜，称量卵巢质量，称重后立即用生理盐水冲洗，置于4%多聚甲醛溶液中。常规脱水、石蜡包埋。 每个蜡块分别以 4 μ m 厚度切片多次，常规 HE染色。

1.6 统计学分析

应用SPSS 22.0软件对实验数据进行统计学分析，计量资料以表示，进行t检验，P＜ 0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组大鼠实验前后体质量及血清睾酮含量变化

HFD组及实验组大鼠体质量与对照组大鼠相比，无统计学差异 （P＞ 0.05） 。HFD组与实验组均有明显高雄激素血症表现，血清中睾酮含量均较对照组有统计学差异 （P＜ 0.05） 。见表1。

表1 各组大鼠体质量及睾酮水平比较Tab.1 Animal weight and serum concentration of TESTO in each group

2.2 各组大鼠卵巢形态学变化

实验组和HFD组大鼠卵巢表面苍白，包膜增厚，可见囊状卵泡形成。其中HFD组囊状卵泡数量和卵泡数量比值较实验组变化更加明显。见表2。对照组卵巢表面颜色红润，未见明显囊状卵泡突起。

2.3 各组大鼠卵巢病理学变化

HFD组及实验组大鼠卵巢均可见明显囊性扩张的卵泡，其卵泡内卵母细胞消失，卵巢颗粒细胞层数减少至2～3层，囊状扩张卵泡数量明显增多。HFD组囊状卵泡与卵泡总数比值较实验组更大。对照组可见数个黄体及不同发育时期的卵泡，卵巢颗粒细胞层数为8～9层。见图1。

表2 实验组和HFD组大鼠卵巢形态学比较Tab.2 Pathological changes in the ovaries of rats in the experimental group and the high-fat diet group

图1 各组大鼠卵巢组织HE染色切片Fig.1 Representative images of HE staining of ovarian sections from a single rat in each group

3 讨论

PCOS是影响育龄期女性最常见的内分泌疾病，近年来研究［1-2，7］表明，该疾病与腹型肥胖、胰岛素抵抗、二型糖尿病等密切相关。有研究［6］表明，长期暴露于雄激素环境中，大鼠可以表现出典型的PCOS特点，包括肥胖、胰岛素抵抗这些代谢紊乱的表现及卵巢多囊样改变的病理生理特点。MIAO等［8］采用DHEA皮下注射成功构建起大鼠PCOS模型，且卵巢病理学改变及血清生化指标检验接近实际临床病例。本研究采用DHEA构建PCOS模型，其主要原理为在卵泡膜细胞上DHEA能促进睾酮经Δ4途径的合成，导致血睾酮水平升高，从而引起卵泡闭锁，无排卵。本研究中实验组及HFD组卵巢表面苍白且呈多囊性改变，闭锁卵泡直径增大，卵母细胞或放射冠缺失，颗粒细胞层数减少，白膜增厚，与国内外研究［1-2，6-8］一致。然而在本研究中，实验组大鼠并没有表现出明显的体质量增长变化，导致这种现象发生的原因可能和饮食等环境因素有关。但也有文献［9］报道，DHEA可能会引起小鼠能量摄入降低，从而导致体质量减轻，肥胖女性口服DHEA-S可能通过将DHEA转换为雌激素降低脂肪含量增加而降低体质量［10］。

研究［3］表明，在高脂饲养条件下，大鼠会发生代谢改变并加剧大鼠发生多囊卵巢样改变。有实验［11］证明，对大鼠喂以高脂饲料可加剧大鼠表现出肥胖、胰岛素抵抗和抑郁行为等症状，有文献［12］报道，饮食可以诱导肥胖小鼠血液中睾酮含量明显升高，AKAMINE等［13］给予大鼠HFD后，模型组腹膜后及性腺周围脂肪、胰岛素抵抗指数均明显升高，这些表现符合PCOS的一般表现及代谢特点。然而，单独应用HFD构建PCOS模型耗时久，在血清性激素水平和卵巢形态学改变方面不典型，因此HFD常与激素诱导联合应用。DHEA造模法具有明显的胰岛素抵抗这一特点［14］。因此，本研究在DHEA的基础上联合HFD构建大鼠PCOS模型。本研究中2种建模方法均成功构建出大鼠PCOS模型，2种造模方法的大鼠均表现出高雄激素血症，卵巢均发生多囊样改变，但DHEA联合HFD造模法较单纯DHEA造模法卵巢形态学及组织病理学变化更加显著。

综上所述，DHEA联合HFD构建PCOS大鼠模型在血清激素水平及组织病理学上变化更加明显，模型大鼠表现出不排卵及卵巢多囊样改变，是一种可靠的PCOS动物建模方法。