调控Nedd4—2泛素化降解上皮离子通道的研究进展

张豪 田苗 孙小虎 欧阳露

[摘要] 神经前体细胞表达发育抑制蛋白4-2（Nedd4-2）是一种泛素-蛋白连接酶，属于泛素连接酶E3 HECT家族，主要参与蛋白质降解过程，在细胞分化、凋亡等生命活动中发挥重要作用。上皮钠离子通道（ENaC）是细胞膜上的一种糖基化大分子蛋白，在肾脏、肺等组织中，主要调节机体Na+的转运、液体的重吸收，其结构、功能异常，与诸多疾病的发生发展有关。相关研究表明，Nedd4-2参与ENaC调节，从而调控机体相关功能。本文通过回顾近几年国内外文献，总结了Nedd4-2、ENaC的结构与功能及调控Nedd4-2泛素化降解ENaC的相关研究进展。

[关键词] 神经前体细胞表达发育抑制蛋白4-2；泛素化；上皮钠通道；研究进展

[中图分类号] R33 [文献标识码] A [文章编号] 1673-7210（2018）07（a）-0037-05

Research progress of ubiquitination epithelial sodium channel by the regulation of Nedd4-2

ZHANG Hao1 TIAN Miao2 SUN Xiaohu3 OUYANG Lu4

1.School of Dentistry， Hubei University of Medicine， Hubei Province， Shiyan 442000， China；2.School of Nursing， Hubei University of Medicine， Hubei Province， Shiyan 442000， China； 3.Department of Gynecology， Maternal and Child Health Hospital of Shiyan City， Hubei Province， Shiyan 442000， China；4.Department of Pharmacy， Shiyan Renmin Hospital Affliated to Hubei University of Medicine， Hubei Province， Shiyan 442000， China

[Abstract] Neural precursor cell expressed developmentally down-regulated protein 4-2 （Nedd4-2） is a ubiquitin protein ligase of the E3 HECT family， which is known to bind and regulate a number of membrane proteins， and mediate diverse extracellular signals， such as cell differentiation and apoptosis. Epithelial sodium channel （ENaC） is an integral membrane protein， plays a crucial role in Na+ transport and fluid reabsorption in the kidney and lung， whose structural abnormalities or disfunctions may cause some diseases. At present， Nedd4-2 protein participate in the regulation of ENaC and regulate the function of the body. This paper reviewed the structure and function of the Nedd4-2 and ENaC， and summarized the regulation of ENaC trafficking by Nedd4-2.

[Key words] Neural precursor cell expressed developmentally down-regulated protein 4-2； Ubiquitination； Epithelial sodium channel； Research progress

泛素化在蛋白質翻译后修饰过程中起着重要作用，是内源性蛋白质降解的主要途径之一，在调控细胞生命活动中发挥重要作用，其功能失调与心血管疾病、骨代谢疾病的发病密切相关[1]。在泛素化修饰过程中，E3酶是关键酶，能特异性识别底物。E3酶根据结构可分为3种：E6-相关蛋白羧基末端同源（homologous to E6-associated protein c-terminus，HECT）家族、环指E3（RING finger）及U-box家族，神经前体细胞表达发育抑制蛋白4-2（Nedd4-2）是HECT家族中最大的成员[2]，本文主要探讨泛素连接酶Nedd4-2。

上皮钠离子通道（ENaC）是细胞膜上的一种糖基化大分子蛋白，存在于肺、肾脏、骨骼等组织，对机体Na+重吸收、维持水钠平衡、血压调节至关重要。近年来研究表明，调控Nedd4-2泛素化降解ENaC，从而参与某些疾病的发生发展如急性肺水肿[3]、高血压[4]等。本文就近年来调控Nedd4-2泛素化降解ENaC的相关研究进行综述。

1 泛素（Ubiquitin，Ub）与泛素连接酶Nedd4-2

1.1 Ub

Ub是一种高度保守的多肽，由76个氨基酸构成，因在机体中广泛分布、含量丰富而被称为Ub。Ub共价结合于底物蛋白的赖氨酸残基，被Ub标记的蛋白质将被特异性地识别并迅速降解。目前，国内外普遍认为泛素化过程是一个三酶级联反应，需要3种酶参与：泛素激活酶E1、泛素结合酶E2、泛素连接酶E3。在ATP提供能量的条件下，E1酶将Ub激活；激活后的Ub与E2酶结合，同时E3酶特异地识别底物，并引导E2酶将Ub结合到底物蛋白上，重复上述过程，当底物连接至少4个Ub时，26s蛋白酶将其水解成肽段，并释放出Ub继续参与循环过程。由于蛋白酶体识别蛋白质并将其降解是一个非特异性的过程。因此，E3酶在整个蛋白质泛素化过程中发挥了重要的作用，决定了反应的特异性。

1.2 Nedd4-2结构及表达

Nedd4-2是一种泛素-蛋白连接酶，属于E3 HECT家族，该家族有9位成员：Nedd4、Nedd4-2、ITCH、SMURF1、WWP1、WWP2、NEDL1和NEDL2[5]。所有的Nedd4 E3成員都具有类似的结构：1个位于N-末端与膜结合的C2结构域，2～4个负责与蛋白-蛋白相互作用的WW结构域及1个位于C-末端负责结合泛素蛋白的HECT结构域[2]。见图1。

WW结构域由35～40个氨基酸构成，具有2个保守的色氨酸残基，通常WW结构域与靶蛋白的PY（PPxY）模体或底物蛋白的磷酸丝/苏氨酸残基结合[6]。Nedd4-2成员含有多种WW结构域，提示其可与多种蛋白结合。C2结构域由约120个氨基酸组成的Ca2+结合区域，可与磷脂或某些蛋白质结合。HECT结构域是由约350个氨基酸组成催化区域，分为C-lobe和N-lobe，N-lobe与E2酶结合，C-lobe包含半胱氨酸受体，其主要负责Ub的转移[7]。

进化分析表明，Nedd4-2在脊椎动物中的表达高度保守。人类的Nedd4-2基因位于染色体18q21.31，包含38个外显子，因而可以转录多种Nedd4-2-mRNA。在NCBI数据库中检索发现，人类的Nedd4-2至少有17种亚型，它们具有类似的结构：4个WW结构域、C2及HECT结构域[8]。研究发现，Nedd4-2在肝脏、肾脏、肺等组织中高度表达[8]。

2 ENaC的结构与功能

ENaC蛋白属于ENaC/Deg超家族，是细胞膜上的一种糖基化大分子蛋白。ENaC由α、β、γ 3种同源亚基组成，每个亚基都有2个跨膜区域（TM1和TM2）、胞内的氨基端和羧基端及1个大的细胞外环结构[9]，以2α1β1γ四聚体结构为主要组成方式，其中α亚基是主要的功能单位，β和γ亚基为附属亚基[10]。最近，发现ENaC还存在δ亚基，并且δ亚基的存在可以增强ENaC的功能[11]。

ENaC属于非电压依赖性通道，受细胞膜上电位变化的影响较小，对Na+的选择性远高于K+，此作用可被特异性抑制剂阿米洛利（Amiloride）及其类似物阻断。Na+跨膜转运包括两个步骤：Na+顺着电化学梯度通过极化膜上的ENaC进入细胞，细胞内的Na+再通过基侧膜上的Na+-K+-ATP酶泵出细胞外。这种活性的跨上皮细胞Na+转运对于维持水钠平衡、血容量及血压起重要作用[9]。近年来研究表明，ENaC失活或阻塞与某些疾病的发生有关，如α或β或γ亚基发生基因突变，导致肾脏远曲小管对Na+、水重吸收增强，引发Liddle综合征[12]。

3 Nedd4-2对ENaC的调节机制

Nedd4-2主要介导离子通道蛋白的泛素化降解过程，其通过WW结构域与靶蛋白的PY模体或底物蛋白的磷酸丝/苏氨酸残基相互作用，从而介导靶蛋白降解[8]。ENaC的α、β、γ亚基羧基端有PY模体，Nedd4-2的WW结构域与ENaC的PY模体结合，从而促使ENaC泛素化，降低细胞膜上ENaC的表达[13]。当β或γ亚基突变或Nedd4-2被磷酸化时，Nedd4-2与ENaC相互作用减弱，导致ENaC功能异常活跃，血压升高、肾脏远曲小管对Na+重吸收增强，引发Liddle综合征[14]。邓旺等[15]采用胰岛素刺激肺泡上皮Ⅱ型细胞，发现Nedd4-2蛋白的表达受到抑制，细胞膜上的αENaC蛋白的表达增加，从而加速肺泡内液体清除，缓解急性肺损伤。此外，δ亚基未发现PY模体[16]。

3.1 Usp2-45/Nedd4-2通路

泛素特异性加工酶2-45（ubiquitin-specific protease 2-45，Usp2-45）是Usp2的产物。Usp2因mRNA的选择性拼接而生成2种亚型，即Usp2-45和Usp2-69，它们具有共同的水解核心[17]。研究发现，Usp2-45 mRNA在许多组织中均有表达（除肺与胆囊），其与骨骼肌纵向生长、离子通道活性调节有关[18]。

前期研究证实[19]，Usp2-45可将ENaC去泛素化，减少ENaC被Nedd4-2泛素化降解，增加细胞膜上ENaC的表达及活性。进一步研究发现，这种现象是由于Usp2-45改变了ENaC的构象[20]。Oberfeld等[21]认为，Usp2-45的N-端和C-端都可与Nedd4-2的HECT域结合，降低Nedd4-2的活性，减弱Nedd4-2对ENaC的泛素化降解，增加细胞膜上ENaC的表达。

3.2 Ndfip2/Nedd4-2通路

Nedd4-2家族交互作用蛋白（Nedd4 family interacting protein 2，Ndfip2）是由Harvey等[22]在2002年发现的。Ndfip2主要分布于高尔基体、核内体及多泡小体，其具有3个跨膜区域，在C-端具有两个PY模体，可与Nedd4-2的WW结构域结合[23]。Shearwin等[24]在研究HEK293T时发现，Ndfip2的PY模体与Nedd4-2的WW结构域结合，从而阻止Nedd4-2与ENaC的结合，增加细胞膜上ENaC的表达。

3.3 cAMP/PKA/Nedd4-2通路

cAMP/PKA/Nedd4-2是调节ENaC的一条重要通路。既往认为cAMP大多数生理功能都是通过PKA实现的。cAMP是细胞内第二信使，胞外某些信号分子，如细胞因子，与G蛋白偶联受体结合后激活腺苷酸环化酶，催化ATP生成cAMP，从而激活PKA[25]。Snyder等[26]研究发现，PKA被cAMP激活后，将Nedd4-2磷酸化，阻止Nedd4-2的WW结构域与ENaC结合，从而减弱Nedd4-2对ENaC泛素化作用。此外，有文献报道cAMP激活PKA后，环磷腺苷效应元件结合蛋白（cAMP-response element binding protein，CREB）上的丝氨酸氨残基被PKA磷酸化，磷酸化的CREB与转录共激活因子CREB结合蛋白结合到cAMP反应元件上，从而增加ENaC的转录[27]。

3.4 Sgk1/Nedd4-2通路

血清-糖皮質激素诱导的蛋白激酶（serum and glucocorticoid-inducible kinase，Sgk）属于AGC家族成员，是一种Ser/Thr蛋白激酶，由N-末端、中间催化结构域及C-末端组成。Sgk有3种同源体：Sgk1、Sgk2和Sgk3，且Sgk2、Sgk3与Sgk1的N末端结构不同[28]。尽管这3种同源体都可以调节ENaC的活性，但是目前Sgk1调节ENaC研究最为详细[28]。

研究发现，Sgk1参与ENaC活性的调节[29]。Nedd4-2有3个氨基酸残基：Ser-221、Thr-246、Ser-327，它们都是Sgk1的底物。当Sgk1与它们结合时，Nedd4-2被磷酸化，从而减弱Nedd4-2对ENaC的泛素化作用[29]。14-3-3蛋白是一种广泛存在于真核生物体内的酸性蛋白质，Sgk1可促进Nedd4-2与14-3-3结合，导致Nedd4-2构象发生改变，从而阻止了Nedd4-2对ENaC的泛素化作用[30]。此外，研究发现，Sgk1也含有PY模体，可直接与Nedd4-2的WW结构域结合，从而促进ENaC的活性[31]，提示Sgk1/Nedd4-2可能通过3种方式调节ENaC：①Sgk1直接与Nedd4-2的氨基酸残基结合，将Nedd4-2磷酸化；②Sgk1可促进Nedd4-2与14-3-3结合；③Sgk1的PY模体与Nedd4-2的WW结构域结合，从而阻断Nedd4-2对ENaC的泛素化，提高细胞膜上ENaC表达。

3.5 Akt/Nedd4-2通路

蛋白激酶B（Protein kinase B，PKB或Akt）属于AGC家族成员，其有3种同源体：Akt1、Akt2、Akt3。Akt是PI3K下游底物，当受到胰岛素等分子刺激时，PI3K/Akt通路被激活。此时，Akt被活化，并将Nedd4-2磷酸化，从而增强ENaC的活性；当PI3K被抑制时，Akt不能被活化，此时Nedd4-2表达增加[15]。提示Akt通过磷酸化Nedd4-2，减弱Nedd4-2对ENaC的泛素化作用。

3.6 AMPK/Nedd4-2通路

AMP依赖的蛋白激酶（Adenosine 5‘-monophosphate-activated protein kinase， AMPK）是生物能量代谢调节的关键分子，受AMP/ATP比值调控，从而调控能量代谢。当骨骼肌收缩或心肌缺血时，AMPK被激活，从而调节脂肪细胞的代谢与血管功能，促进葡萄糖转运和脂肪酸的氧化[32]。近年来发现，AMPK参与了ENaC活性的调节。Bhalla等[33]认为，当受到代谢应激刺激时，AMPK被活化，活化的AMPK将Nedd4-2磷酸化，促进ENaC的β亚基与Nedd4-2结合，加快ENaC泛素化降解，从而抑制ENaC的活性。

4 小结

信号通路调节是细胞生命活动的基础，同时也是诸多药物的靶点。本文通过回顾相关文献，发现由Nedd4-2介导ENaC泛素化与诸多疾病的发生发展密切相关，如Liddle综合征，它是一种常染色体显性遗传的单基因高血压病，其临床表现为早发的高血压、低醛固酮血症等。当ENaC的β或γ亚基突变时，Nedd4-2不能与ENaC结合，使得ENaC不能被正常泛素化降解，导致ENaC功能异常活跃，Na+重吸收增加，引起Liddle综合征[14]。然而，目前对Nedd4-2/ENaC通路研究仍然有限。

Na+是体内大量存在的阳离子，承担着维持机体酸碱平衡，调节细胞内外水分等重要作用。在骨骼中，Na+含量约占到体内总钠量的50%。据报道，Na+摄入量的异常与代谢性骨病的发生密切相关[34]，而ENaC是调节Na+平衡的重要途径。本课题组前期研究发现，ENaC参与了成骨细胞活性及功能的调节，从而参与骨代谢的调节[35]。Nedd4-2/ENaC信号通路是否参与了成骨细胞活性及功能的调节，从而参与骨代谢，目前国内外鲜有相关报道。为此，今后将展开深入研究，探讨Nedd4-2/ENaC信号通路与代谢性骨病发病机制是否存在相关性，并为代谢性骨病的治疗提供理论依据。

[参考文献]

[1] Weller CE，Pilkerton ME，Chatterjee C. Chemical strategies to understand the language of ubiquitin signaling [J]. Biopolymers，2014，101（2）：144-155.

[2] Rotin D，Kumar S. Physiological functions of the HECT family of ubiquitin ligases [J]. Nat Rev Mol Cell Biol，2009， 10（6）：398-409.

[3] Qi D，He J，Wang D，et al. 17beta-estradiol suppresses lipopolysaccharide-induced acute lung injury through PI3K/Akt/SGK1 mediated up-regulation of epithelial sodium channel（ENaC）in vivo and in vitro [J]. Respir Res，2014，159（1）：1-12.

[4] Henshall TL，Manning JA，Alfassy OS，et al. Deletion of Nedd4-2 results in progressive kidney disease in mice [J]. Cell Death Differ，2017，24（12）：2150-2160.

[5] 蒋笑，张还添，查振刚.泛素连接酶E3 Nedd4结构域家族对成骨细胞增殖成熟分化的调节[J].广东医学，2015， 36（3）：475-478.

[6] Micel LN，Tentler JJ，Smith PG，et al. Role of ubiquitin ligases and the proteasome in oncogenesis：novel targets for anticancer therapies [J]. J Clin Oncol，2013，31（9）：1231-1238.

[7] 袁铭.E3泛素连接酶NEDD4L在抗病毒固有免疫应答中的调控及机制研究[D].上海：第二军医大学，2016.

[8] Goel P，Manning JA，Kumar S. NEDD4-2（NEDD4L）：the ubiquitin ligase for multiple membrane proteins [J]. Gene，2015，557（1）：1-10.

[9] Hanukoglu I，Hanukoglu A. Epithelial sodium channel（ENaC）family：Phylogeny，structure-function，tissue，distribution，and associated inherited diseases [J]. Gene，2016， 579（2）：95-132.

[10] Ji HL，Zhao RZ，Chen ZX，et al. delta ENaC：a novel divergent amiloride-inhibitable sodium channel [J]. Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol，2012，303（12）：L1013-L1026.

[11] Haerteis S，Krueger B，Korbmacher C，et al. The delta-subunit of the epithelial sodium channel（ENaC）enhances channel activity and alters proteolytic ENaC activation [J]. J Biol Chem，2009，284（42）：29024-29040.

[12] 梁致如，高凌根，范利.Liddle綜合征研究进展[J].中华老年多器官疾病杂志，2016，15（5）：387-391.

[13] Minegishi S，Ishigami T，Kino T，et al. An isoform of Nedd4-2 is critically involved in the renal adaptation to high salt intake in mice [J]. Sci Rep，2016，6（1）：27137-27150.

[14] 徐玉萍，方圆圆，赵志刚.Liddle综合征触发蛋白ENaC的PY模体突变型的结合肽段的筛选[J].中国生物化学与分子生物学报，2014，30（9）：888-893.

[15] 邓旺.胰岛素通过PI3K/Akt信号通路调控急性肺损伤ENaC介导的肺泡液体清除的机制研究[D].重庆：重庆医科大学，2013.

[16] Waldmann R，Champigny G，Bassilana F，et al. Molecular cloning and functional expression of a novel amiloride-sensitive Na+ channel [J]. J Biol Chem，1995，270（46）：27411-27414.

[17] Park KC，Kim JH，Choi EJ，et al. Antagonistic regulation of myogenesis by two deubiquitinating enzymes，UBP45 and UBP69 [J]. Proc Natl Acad Sci USA，2002，99（15）：9733-9738.

[18] 茅幸，张志刚，吴慧娟.泛素特异性加工酶2的研究进展[J].国际病理科学与临床杂志，2012，32（5）：400-405.

[19] Pouly D，Debonneville A，Ruffieux-Daidie D，et al. Mice carrying ubiquitin-specific protease 2（Usp2）gene inactivation maintain normal sodium balance and blood pressure [J]. Am J Physiol Renal Physiol，2013，305（1）：F21-F30.

[20] Ruffieux-Daidie D，Poirot O，Boulkroun S，et al. Deubiquitylation regulates activation and proteolytic cleavage of ENaC [J]. J Am Soc Nephrol，2008，19（11）：2170-2180.

[21] Oberfeld B，Ruffieux-Daidie D，Vitagliano JJ，et al. Ubiquitin-specific protease 2-45（Usp2-45）binds to epithelial Na+ channel（ENaC）-ubiquitylating enzyme Nedd4-2 [J]. Am J Physiol Renal Physiol，2011，301（1）：F189-F196.

[22] Harvey KF，Shearwin-Whyatt LM，Fotia A，et al. N4WBP5，a potential target for ubiquitination by the Nedd4 family of proteins，is a novel Golgi-associated protein [J]. J Biol Chem，2002，277（11）：9307-9317.

[23] Trimpert C，Wesche D，de Groot T，et al. NDFIP allows NEDD4/NEDD4L-induced AQP2 ubiquitination and degradation [J]. PLoS One，2017，12（9）：e183 774-183 792.

[24] Shearwin-Whyatt LM，Brown DL，Wylie FG，et al. N4WBP 5A（Ndfip2），a Nedd4-interacting protein，localizes to multivesicular bodies and the Golgi，and has a potential role in protein trafficking [J]. J Cell Sci，2004，117（16）：3679-3689.

[25] Liu TJ，Zhang JC，Gao XZ，et al. Effect of sevoflurane on the ATPase activity of hippocampal neurons in a rat model of cerebral ischemia-reperfusion injury via the cAMP-PKA signaling pathway [J]. Kaohsiung Journal of Medical Sciences，2018，34（1）：22-33.

[26] Snyder PM，Olson DR，Kabra R，et al. cAMP and serum and glucocorticoid-inducible kinase（SGK）regulate the epithelial Na（+）channel through convergent phosphorylation of Nedd4-2 [J]. J Biol Chem，2004，279（44）：45753-45758.

[27] Mustafa SB，Castro R，Falck AJ，et al. Protein kinase A and mitogen-activated protein kinase pathways mediate cAMP induction of alpha-epithelial Na+ channels（alpha-ENaC）[J]. J Cell Physiol，2010，215（1）：101-110.

[28] Talarico C，Dattilo V，D'Antona L，et al. SGK1，the New Player in the Game of Resistance：Chemo-Radio Molecular Target and Strategy for Inhibition [J]. Cell Physiol Biochem，2016，39（5）：1863-1876.

[29] Ismail NA，Baines DL，Wilson SM. The phosphorylation of endogenous Nedd4-2 In Na（+）-absorbing human airway epithelial cells [J]. Eur J Pharmacol，2014，732（2）：32-42.

[30] Baines D. Kinases as targets for ENaC regulation [J]. Curr Mol Pharmacol，2013，6（1）：50-64.

[31] Chandran S，Li H，Dong W，et al. Neural Precursor Cell-expressed Developmentally Down-regulated Protein 4-2（Nedd4-2）Regulation by 14-3-3 Protein Binding at Canonical Serum and Glucocorticoid Kinase 1（SGK1）Phosphorylation Sites [J]. J Biol Chem，2011，286（43）：37830.

[32] 張景怡，鲍翠玉，李晶.AMPK信号通路在糖尿病心肌病中的研究进展[J].中国药理学通报，2017，33（11）：1496-1499.

[33] Bhalla V，Oyster NM，Fitch AC，et al. AMP-activated kinase inhibits the epithelial Na+ channel through functional regulation of the ubiquitin ligase Nedd4-2 [J]. J Biol Chem，2006，281（36）：26159-26169.

[34] Miller A. Review short：Zenobia Frost's salt and bone [J]. Cordite poetry J，2014，48（1）：1.

[35] 陈珺，林思慧，钟佳贤，等.护骨胶囊含药血清对成骨细胞功能的影响[J].中华中医药杂志，2017，32（12）：5558-5562.

（收稿日期：2017-11-11 本文编辑：王 娟）