天花粉蛋白对肝癌细胞的放射增敏作用及机制研究

2018-11-10陈幼芬夏钕田炳如

现代实用医学 2018年10期

陈幼芬，夏钕，田炳如

作者单位： 315400浙江省余姚，余姚市人民医院

天花粉蛋白是从我国传统中药葫芦科植物栝蒌中提取的I型单链核糖体失活蛋白，最初主要用于妇科疾病的治疗。随后研究发现，天花粉蛋白对众多肿瘤具有抗瘤作用，提示天花粉蛋白可能成为肿瘤治疗的一个新靶点。本研究采用天花粉蛋白处理人肝癌细胞株 HepG2细胞，旨在探讨其对肝癌放射敏感性的影响及其可能作用机制。

陈幼芬，夏钕，田炳如.天花粉蛋白对肝癌细胞的放射增敏作用及机制研究

图1 天花粉蛋白对放射诱导HepG2细胞凋亡的影响（Annexin V-FITC-PI双染法

图2 透射电镜观察HepG2细胞凋亡（A为正常细胞 B为凋亡细胞）

1 资料与方法

1.1 材料

1.1.1 细胞株人肝癌细胞株 HepG2由浙江大学医学院附属第一医院提供。

1.1.2 主要试剂与仪器天花粉蛋白购自上海金山制药有限公司。Annexin VFITCKit购自 Immunotech Company（France）。Epics-XLⅡ型流式细胞仪（Beckman-Coulter Company，USA），JEM-1230型透射电镜（LEOLCompany，Japan）。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养 HepG2培养于含10%灭活胎牛血清的DMEM培养液中，置37℃、5%CO2恒温培养箱内。取指数生长期细胞进行实验。

1.2.2 MTT法检测药物毒性及适宜浓度以每孔6×103个细胞接种于96孔板，贴壁后加入天花粉蛋白，其浓度设0、25、50、100、200 mol/L 5个浓度组，每个浓度组各取12、24、48、72h 4个时间点检测，设不接种细胞的空白对照和只含 1‰DMSO的对照组，每浓度每时间点重复4孔。采用 MTT法在酶联免疫检测仪上测定490 nm处吸光度值（A），细胞存活率（%）=实验孔A值/对照孔A值×100%。

1.2.3 克隆形成实验分析放射增敏效应

制备单细胞悬液，根据不同照射剂量接种适量细胞于75 mm2培养皿中，实验分两组：（1）单照组：细胞接种24h贴壁，继续培养24 h，室温下分别接受0、2、4、6、8、10 Gy 的 6MV X-ray 照射；（2）联合组：照射＋天花粉蛋白处理。细胞接种24h贴壁，联合组更换含50 mol/L的天花粉蛋白培养液，两组继续培养24h，室温下分别接受 0、2、4、6、8、10 Gy的6MV X-ray照射，照射后联合组更换无药培养液与单照组一起继续培养14d。甲醇固定，姬姆萨染色，计数＞50个细胞克隆数。经单纯用药校正后计算存活分数（SF），实验结果为3次平均值。以多靶单击数学模型拟合细胞存活曲线，计算参数平均致死剂量（D0）、准阀剂量（Dq）及放射增敏比（SER）值。

1.2.4 流式细胞术（FCM）检测细胞凋亡率实验分4组：（1）未处理组；（2）单药组：含50 mol/L的天花粉蛋白培养液培养 24 h；（3）单照组：6 Gy 照射剂量；（4）联合组（照射+药物）。各组取处理后细胞 1×106个，按Annexin V-FITCKit说明书操作，加PI和Annexin V-FITC双染液上机检测，利用Coulter公司的SystemⅡTM软件处理结果，每次实验均设阴性和阳性对照，并设3复孔。

1.2.5 透射电镜观察凋亡收集联合组HepG2细胞，2.5%戊二醛固定，2%琼脂包埋，再用1%锇酸固定，逐级乙醇脱水，氧化丙烯浸透，树脂包埋，超薄切片机切片，透射电子显微镜下观察并摄影。

1.3 统计学方法应用SPSS15.0统计软件进行分析，计量资料用±标准差表示，多组比较采用方差分析，两两比较采用SNK-q检验。计数资料采用2检验；P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 天花粉蛋白对HepG2细胞生长的影响 MTT法测定结果显示，天花粉蛋白对 HepG2细胞有明显的抑制生长作用，24 h其细胞存活率最高为（95.97±2.13）%（25 mol/L），最低为（64.20±2.29）%（200 mol/L)，IC50 为266.5 mol/L。为尽量避免药物本身对细胞的毒性作用，在随后的实验中天花粉蛋白都采用50 mol/L浓度。

2.2 天花粉蛋白的放射增敏作用天花粉蛋白可显著增加 HepG2细胞的放射敏感性（图1）。单照组和联合组的D0值分别1.74、1.35Gy；Dq值分别为2.46、1.56 Gy；SER 为 1.30。

2.3 天花粉蛋白诱导凋亡 FCM 显示单药组的凋亡率为（6.03±0.98）%，单照组为（7.64±1.13）%，未处理组为（1.73±0.49）%，联合组为（17.90±2.01）%；4组凋亡率差异有统计学意义（F=9.28，P＜0.05）。单药组和单照组的凋亡率高于未处理组（均P＜0.05），联合组凋亡率明显高于单照组和单药组（均P＜0.05）。见封四彩图1。

2.4 透射电镜观察经药物联合照射处理后的细胞体积缩小，胞膜完整，但发生皱缩，染色质凝聚、固缩、边聚，部分出现核碎裂，胞质出芽，凋亡小体形成。见封四彩图2。

3 讨论

天花粉蛋白是从中药天花粉中提取纯化的一种活性蛋白，已有研究提示具有抑制肿瘤细胞增殖，促进肿瘤细胞凋亡[1-3]；增强NK细胞的杀伤活性[4]以及免疫调节[5]等作用，有着良好的研究前景及应用价值。本研究发现25～200 mol/L浓度的天花粉蛋白对HepG2细胞均有增殖抑制作用；天花粉蛋白联合放射组的细胞生存率较单照组明显降低，即天花粉蛋白对HepG2细胞具有明显的放射增敏作用。

细胞凋亡是一种受基因调控的不同于细胞坏死的特殊类型的细胞死亡，在抗癌药物的药理机制研究中占有重要地位，近年来倍受医学界的关注。齐跃东[1]的研究提示天花粉蛋白通过干扰人大肠癌细胞株 LoVo、人结肠癌细胞株SW-1116及人胃癌细胞株MKN-45的细胞增殖，诱发细胞凋亡来实现抗肿瘤作用。You等[6]的研究也提示天花粉蛋白增加TRAIL抵抗非小细胞肺癌的细胞凋亡及细胞周期阻滞。Zhang等[7]在对几种传统中药对肿瘤研究中发现天花粉蛋白通多 Bcl-PARP通路诱导对肝癌细胞的凋亡诱导作用最为明显。本研究发现天花粉蛋白通过诱导HepG2细胞的凋亡，实现抗肿瘤作用，与上述研究结果一致。

综上所述，在肿瘤的放射治疗中，放射导致细胞凋亡是放射诱导肿瘤细胞死亡的一种形式。放射诱导DNA损伤，激活的P53进行损伤修复，不可修复的损伤将激活凋亡信号通路诱导细胞凋亡。本研究发现放射可诱导HepG2细胞的凋亡，且天花粉蛋白可进一步上调放射对 HepG2细胞的凋亡诱导作用；其增敏机制可能与上调细胞凋亡有关，相关机制有待进一步探讨。ACS Appl Mater Interfaces,2017,9(32)：26648-26664.