电子烟烟液体外毒理学评价用细胞筛选研究

管莹，高茜，李雪梅，徐玉琼，米其利，陆舍铭，熊国行，朱洲海，夭建华

云南中烟工业有限责任公司 云南 昆明 650231

烟草监管立法的日趋严格以及吸烟与健康研究的深入，导致了烟草公司寻求风险更低、无环境烟气的新型烟草制品，并逐步形成了3种主要的新型烟草制品类型。电子烟制品作为其中的一个大类，被确定为当前及今后一段时间国内烟草制品研发的重要内容。

《世界卫生组织烟草控制框架公约》（FCTC）将“电子烟”定义为电子尼古丁传送系统（electronic nicotine delivery systems，ENDS），即用于向呼吸系统传送尼古丁的电子制品，通过电加热或者电子雾化方式使由烟碱、香味物质等组成的液体转化为类似于卷烟烟雾的混合物，再将汽化丙二醇/尼古丁等混合“烟雾”传送至消费者，使人吸入剂量不等的尼古丁而获得类似于抽吸传统卷烟的生理感受。电子烟烟液的主要组成为溶剂，添加剂和烟碱，国外市售的21个规格的电子烟产品的主要溶剂为植物甘油（vegetable glycerol，VG）和丙二醇（propylene glycol，PG）[1]，溶剂在烟液中占比可高达87%（W/W）[2]甚至更高。而对于食用添加剂和电子烟添加剂的使用，FDA反复强调了“可食入不等于可吸入”的立场，两者的安全性评估、应用、监管模式等不得直接照搬，即使电子烟添加剂的成分在食品添加剂范畴内合规。对于电子烟添加剂沿用传统食品添加剂采用的如GRAS、FEMA等管理和归类模式，FDA并不认可[3]，电子烟消费者长期吸入大量的溶剂或烟液，其潜在的安全风险是急需得到关注和重视的。

国外多家烟草公司纷纷采用不同的毒理学方法和化学分析手段对传统卷烟和电子烟制品的安全性进行比较研究，以证明电子烟制品的低风险优势，如Lorillard烟草公司采用对电子烟烟液和气溶胶提取物的细胞毒性、遗传毒性和致突变性进行评价[4,5]；雷诺烟草公司对传统卷烟、无烟气烟草产品、电子烟、尼古丁进行DNA损伤评价[6]；英美烟草对电子烟和传统卷烟的遗传毒性进行比较研究[6]。

然而伴随着评价方法的多样化及评价目的的不同，评价用细胞也各不相同[4-14]，例如雷诺烟草Gao H等[7]为了比较不同的烟草制品对人口腔基因的损伤选取口腔鳞状癌细胞和原代人牙龈上皮细胞为受试细胞；英美烟草Breheny D等为了比较电子烟和传统卷烟促肿瘤作用的差异选取了Bhas42细胞，2004年Ohmori等提出单独使用Bhas42细胞进行化合物癌症促进能力的细胞转化检测；Van der Toorn M等为了研究新型烟草制品对人心血管系统的影响选取人冠状动脉内皮细胞（HCAEC），人单核细胞系（THP-1）为受试细胞[9]；Lerner CA等为了证明电子烟烟液对人呼吸道疾病的影响，选取人肺粘液上皮样癌细胞（H292）、人胚肺成纤维细胞（HFL1）、人支气管上皮细胞（BEAS-2B）细胞为测试细胞[9]。以上研究中，当考察不同的烟草制品对人口腔的影响为目的时选取口腔细胞；评价新型烟草制品对人心血管系统的影响时则选取心血管细胞；评价新型烟草制品对人呼吸道疾病的影响时则选用人呼吸系统细胞。可见研究目的是选取测试用细胞的关键考量因素，除此之外，为了满足批量测试的需要作为常规测试用细胞应易于培养且可长期连续传代。

动物试验的相关研究发现，受试动物吸入电子烟后主要引起其呼吸道系统的组织及细胞发生变化[15-17]，由此可见呼吸道系统是电子烟最直接的作用靶器官，选取呼吸道细胞为评价用细胞，有利于评价电子烟对机体的短期生物学效应。为此，本研究选取电子烟暴露途径中涉及到的上呼吸道、下呼吸道代表性细胞作为候选细胞进行筛选研究，以期为电子烟体外毒理学评价提供参考。其中上呼吸道细胞选取了人口腔黏膜角质化细胞（HOK）、人鼻腔上皮细胞（RPMI 2650）；下呼吸道细胞选取了人支气管上皮细胞（Beas-2b）、人肺成纤维上皮细胞（HPF）、人肺泡上皮细胞（HPAEpiC）；其中，人支气管上皮细胞（Beas-2b）为传统卷烟细胞毒性评价用细胞。本研究采用电子烟常规溶剂和烟液为测试对象开展多种候选细胞筛选研究。

1 材料与方法

1.1 细胞

人口膜角质化细胞、人鼻腔上皮细胞、人肺成纤维上皮细胞、人肺泡上皮细胞，购自ScienCell；人支气管上皮细胞，购自美国模式培养物集存库（American type culture collection，ATCC）。

1.2 主要试剂和仪器

OKM细胞培养基（ScienCell， 美 国）、RPMI1640 细胞培养基（Gibco，美国）、FM细胞培养基（ScienCell，美国）、AEpiCM细胞培养基（ScienCell，美国）、LHC-8细胞培养基（Gibco，美国）、PBS（Gibco，美国）、胰酶（Gibco，美国）、96孔及6孔细胞培养板（Corning，美国）、MTT（Solarbo，中国）、Annexin V-FITC/PI双染细胞凋亡试剂盒（碧云天，中国）、流式细胞仪（贝克曼 QUANTA-SC，

美国）、二氧化碳培养箱（Thermo Forma 3111，美国）、酶标仪（Bio-Rod，美国）。

1.3 样品信息

甘 油（Glycerol）、 丙 二 醇（Propylene Glycol）、1,3-丁二醇（1,3-Butanediol）等本研究使用的溶剂均为食品级，甘油:丙二醇混合物比例为1:2。电子烟烟液测试样品为实验室自主调制的烟液，烟液中含有不同浓度的烟碱（12 mg，18 mg），分别为清香型12 mg（Q12）、清香型18 mg（Q18）、浓香型12 mg（N12）、浓香型18 mg（N18）。

在小麦品种的选择上，要选择品质好、分节强、抗倒伏、抗寒、抗病的小麦品种，充分发挥小麦优良品种在生长过程中的光合能力与抗衰老优势。

1.4 样品前处理方法

根据不同细胞系预实验结果，按照适当比例将细胞培养基加入到电子烟烟液中，用0.22 μm无菌过滤器过滤除菌，获得样品工作液。

1.5 MTT细胞毒性法

选取对数生长期的细胞，用胰酶进行消化，将适量细胞接种于96孔板中，置于37 °C, 5 % CO2培养箱中培养24 h，细胞汇合率大约为90 %时，按照表1加入不同体积的样品工作液和细胞培养基，根据测试细胞的不同加入相对于的细胞培养基，HOK细胞加入OKM细胞培养基、RPMI2650细胞加入RPMI1640 细胞培养基； Beas-2b细胞加入LHC-8细胞培养基、HPF细胞加入FM细胞培养基、HPAEpiC细胞加入AEpiCM细胞培养基，每个浓度8个复孔，置于37 °C，5 % CO2培养箱中培养24 h；换液后加入浓度为5 mg/mL 的MTT溶液，每孔20 μL，置于37 °C, 5 % CO2培养箱中培养4 h；去除溶液，加入DMSO溶液，每孔200 μL，置于微量振荡器上振荡10 min，酶标仪上测量490 nm处吸光值。按公式（1）计算细胞抑制率。

式中:x—细胞抑制率；ODn—样品多孔平均的OD值；ODo—空白多孔平均的OD 值；ODc — 细胞对照的多孔平均的OD 值。

1.6 Annexin V-FITC/PI双染细胞凋亡检测法

取生长状态良好的细胞用胰酶消化，将适宜密度的细胞接种于6孔板中，每孔2 mL，置于37 ℃，5 % CO2培养箱中培养24 h。取出6孔细胞培养板，去除细胞培养液，按表2在细胞培养板中加入不同体积的样品工作液和细胞培养基，根据测试细胞的不同加入相对于的细胞培养基，每个样品浓度设3个复孔，置于37 ℃, 5 % CO2培养箱中培养24 h。取出细胞培养板，将每孔中的细胞和培养液收集到15 mL离心管内，1000 r/min，4 ℃离心5 min，弃上清，收集细胞。经PBS洗涤2次，离心后收集细胞，用100 μL的染料结合液重悬细胞，加入5 μL的Annexin V-FITC和5 μL的PI染料，混匀后在避光、室温条件下反应10 min，再加入400 μL的染料结合液混匀得到检测样品，在1 h内用流式细胞仪检测。

表1 MTT细胞毒性试验加样表Tab.1 MTT cytotoxicity test sample table

表2 细胞凋亡试验加样表Tab.2 Apoptosis detection sample table

1.7 细胞倍增试验

取对数生长期的细胞，用胰酶消化，吹打均匀，细胞计数后各类细胞按5×104个/mL的细胞密度接种于24孔板中，每孔0.5 mL，培养24 h后各取3孔，弃去培养液及未贴壁细胞，加入1 mL PBS洗涤2次后去上清，用胰酶消化贴壁细胞后进行细胞计数, 按公式(2)计算细胞倍增时间：

式中：

TD——T1至T2时间内细胞的倍增时间；

N2——T2时间的细胞数。

1.8 统计学方法

采用SPSS 18.0 软件进行one-way ANOVA 单因素方差分析法，对不同细胞系测试结果间的差异进行分析。

2 结果与分析

2.1 电子烟溶剂和烟液对不同受试细胞的细胞毒性

不同溶剂对不同受试细胞存活率的影响结果如图1所示，1,3-丁二醇的细胞毒性高于其余7种样品，差异达到显著水平，而其余7种样品间的细胞毒性无显著差异。随着样品浓度的增加，受试的5种细胞的存活率均呈下降趋势，存在剂量效应关系，不同的受试细胞对相同的样品测试结果定性结果一致，样品间相对定量趋势一致。根据细胞抑制率分别计算溶剂和烟液对不同受试细胞的半数抑制剂量IC50，结果如图2所示，不同的受试细胞对溶剂和烟液的耐受性存在显著差异，当受试样品相 同时，HPF细胞的IC50值最高，Beas-2b细胞、RPMI 2650细胞次之，HPAEpiC细胞、HOK细胞较低，HPF细胞、Beas-2b细胞、RPMI 2650细胞的耐受性较好。

图1 电子烟溶剂及烟液对不同细胞存活率的影响Fig.1 Effect of solvents and e-liquids on cell viability of different cells

图2 电子烟溶剂及烟液对不同受试细胞IC50值的比较Fig.2 Comparison of IC50 values of different test cell lines by solvents and e-liquids

2.2 电子烟溶剂和烟液对不同受试细胞早期凋亡率的影响

不同的电子烟溶剂和烟液对不同受试细胞的早期凋亡率的影响结果如图3所示，在受试的4种溶剂样品及4种电子烟烟液样品中，清香型12 mg、清香型18 mg会引起受试细胞早期凋亡。随着清香型12 mg、清香型18 mg样品浓度的增加，受试的5种细胞的早期凋亡率均呈上升趋势，存在剂量效应关系，而其余6种受试样品则未引起受试细胞早期凋亡，不同的受试细胞对相同的样品测试结果样品间相对定量趋势一致。电子烟溶剂和烟液原液对不同受试细胞早期凋亡率的比较结果如图4所示，不同的受试细胞对相同的样品测试结果定性结果一致。

清香型12 mg、清香型18 mg与浓香型12 mg、浓香型18 mg烟液的使用溶剂及比例一致，且均含有烟碱，其差异在于使用了不同的香精香料物质。浓香型12 mg、浓香型18 mg烟液未引起细胞凋亡，而清香型12 mg、清香型18 mg烟液则引起细胞凋亡，表明清香型12 mg、清香型18 mg电子烟烟液样品中使用的某种或某几种香精香料物质引起了细胞的凋亡，电子烟溶剂和烟碱不是引起细胞凋亡的原因。

图3 电子烟溶剂及烟液对不同细胞早期凋亡率的影响Fig.3 Effect of solvents and e-liquids on early apoptosis rates of different cells

图4 电子烟溶剂及烟液对不同受试细胞早期凋亡率的比较Fig.4 Comparison of early apoptosis rates of different test cell lines by solvents and e-liquid

2.3 不同细胞系倍增时间的比较

将HOK细胞、RPMI 2650细胞、Beas-2b细胞、HPF细胞、HPAEpiC细胞培养24 h后的细胞倍增时间进行比较，结果如图5所示，RPMI 2650细胞和HPF细胞倍增时间显著低于其余3种细胞（P＜0.05）9～13 h增殖一代。

图5 不同细胞系倍增时间的比较Fig.5 Comparison of doubling time of different cell lines

3 讨论

本研究采用电子烟吸入暴露途径中涉及到的上呼吸道、下呼吸道代表性细胞作为候选细胞进行比较研究。其中上呼吸道细胞为HOK细胞、RPMI 2650细胞；Beas-2b细胞、HPF细胞、HPAEpiC细胞。

细胞结构与功能的改变是机体受到外源性有害物质作用所致损伤的基础，细胞受损严重时细胞死亡，多篇文献[4-5,10]在对电子烟的不同毒理学性质进行评价前，均对其细胞毒性进行测试，获得适宜的测试剂量范围用于进一步的生物学效应的评价。现有的文献报道中，虽然选取的细胞种类有所差异，测试的电子烟样品状态也有所不同，但在测试剂量范围内，无论是电子烟烟液、电子烟气溶胶捕集物在测试剂量范围内均对受试细胞存在不同程度的细胞毒性[4-5,10]。

细胞死亡分被动死亡（细胞坏死）和主动死亡（细胞凋亡）。细胞坏死是指细胞受到环境因素的影响，导致细胞死亡的病理过程。而细胞凋亡并不是病理条件下自体损伤的一种现象，而是为更好地适应生存环境而主动争取的一种死亡过程，它涉及一系列基因的激活、表达以及调控等的作用。因此，选用细胞毒性法和Annexin V-FITC/PI双染法细胞凋亡试验作为评价方法，可用于电子烟溶剂和烟液对受试细胞的细胞损伤的综合性评价，同时对不同细胞的细胞倍增时间进行比较，综合细胞的耐受性、细胞增殖特性及试验操作性选取适合于电子烟体外毒理学评价用细胞。

细胞毒性和细胞凋亡试验结果均显示，不同受试细胞，样品间的定性结果一致，定量结果相对高低趋势一致， 以上候选细胞均能用于溶剂和烟液的生物学效应测试。根据相同溶剂和烟液对不同受试细胞的IC50值，不同的受试细胞对溶剂和烟液的耐受性存在显著差异，当受试溶剂或烟液相同时，HPF细胞的IC50值最高，Beas-2b细胞、RPMI 2650细胞次之，HPAEpiC细胞、HOK细胞较低，HPF细胞、Beas-2b细胞、RPMI 2650细胞的耐受性较好。细胞倍增时间结果显示，在24 h的测试周期内，RPMI 2650细胞和HPF细胞的增殖较快。综合细胞的耐受性、细胞增殖特性及试验操作性，建议选取上呼吸道细胞RPMI 2650细胞和下呼吸道细胞HPF细胞为电子烟体外毒理学测试用细胞。

在细胞凋亡试验中，本研究采用的4种实验室自主调制的烟液进行了比较试验，清香型12 mg、清香型18 mg烟液引起细胞凋亡，而清香型12 mg、清香型18 mg与浓香型12 mg、浓香型18 mg烟液的使用溶剂及比例一致，且均含有烟碱，其差异在于使用了不同的香精香料物质。表明清香型12 mg、清香型18 mg电子烟烟液样品中使用的某种或某几种香精香料物质引起了细胞的凋亡，浓香型12 mg、浓香型18 mg烟液在安全性上优于清香型12 mg和清香型18 mg烟液。本研究建立的基于人呼吸道细胞的体外毒理学评价方法除了可用于产品的安全性评价外，还可用于实验室研发过程中候选配方的初步筛选。