大鼠局灶性脑缺血再灌注后LPA1的表达对神经元凋亡的影响

王燕 张兆辉 陈阳

脑血管病具有较高发病率、致残率和病死率的特点，严重危害着人类的健康和生命，目前已经成为导致全球人口死亡的第二大病因[1]，其中缺血性脑卒中占60%～80%[2]。但迄今为止，脑卒中后神经功能缺损机制尚不明确，因此缺乏针对性的治疗措施，缺血性脑损伤是诱导神经细胞凋亡基因表达最强烈的刺激之一，因此减少缺血性脑损伤后神经细胞凋亡，保护脑缺血后神经细胞成为缺血性脑卒中治疗的方法之一。

溶血磷脂酸(Lysophosphatidic acid,LPA)是一种在生物体内广泛存在的细胞间磷脂信号分子，LPA及其受体在神经系统中发挥多种作用，参与多种神经精神病理过程[3-6]。前期的研究显示LPA在缺血性脑卒中急性期患者血浆中表达增多[7-8]；LPA可于体外条件下诱导神经元凋亡[9]、胶质增生[10-11]及破坏血脑屏障[12]，从而参与神经血管单元的破坏。但在体内环境中缺血性脑卒中后表达上调的LPA对神经血管单元的具体功能和作用机制尚不清楚。我们前期工作显示MCAO大鼠梗死区LPA1的mRNA水平明显高于假手术组，且在术后48h达到高峰。因此，本研究选取术后48h这一时间点，检测MCAO大鼠脑缺血半暗带LPA1蛋白的表达水平，并应用LPA1拮抗剂，以初步明确脑缺血后水平升高的LPA1对缺血半暗带神经元凋亡的作用，并初步探讨其可能的作用机制。

1 材料与方法

1.1 材料及主要仪器

实验对象为SD雄性大鼠，级别为SPF级，体重240～270 g，购于武汉大学动物实验中心，线栓购于北京沙东生物技术有限公司，病理组织切片机购于德国Leitz公司，酶标仪购于美国Bio-Tek公司，荧光显微镜购于宁波舜宇仪器有限公司，RIPA裂解液购于北京普力莱基因技术有限公司，BCA试剂盒购于美国Thermo公司，红四氮唑(TTC) 购于武汉科瑞生物技术有限公司，Ki16425购于Selleckchem公司，Akt一抗、Phospho-Akt一抗和Caspase-3一抗购于美国Cell Signaling公司，Tanon 5200化学发光成像系统购于北京原平皓生物技术有限公司，兔红二抗和鼠绿二抗购于谷歌生物科技有限公司。

1.2 方法

1.2.1 大鼠大脑中动脉栓塞(MCAO)模型制备

将24只SD雄性大鼠随机分为4组，每组各6只。A组为假手术组，B组为MCAO组，C组为MCAO+溶剂对照(Vehicle)组，D组为MCAO+ LPA1抑制剂(Ki16425)组。参照 Zea-Longa 线拴法[13]复制左侧大脑中动脉闭塞模型。假手术组将线栓送至目的部位后即刻拔出，其余试验流程均与手术组相同。

1.2.2 右侧侧脑室注药

C、D 2组在拔线栓后分别立即行右侧侧脑室注射10 μl Vehicle(由2 μl DMSO+10 mL PBS配制而成)、10 μl Ki16425(由0.95 mg Ki16425粉末+1 mL DMSO制成2 mM Ki16425，再从上述1 mL混合液中取出2 μl加入10 mL PBS配制而成)。具体方法如下：用10%水合氯醛按0.35 mL/100 g剂量标准麻醉大鼠，俯卧位固定，备皮消毒后在头顶正中线剪一1 cm左右的切口，分开颅骨上附着的组织，钝性分离颅顶筋膜，找准前囟，并标记开颅点[14](前囟前0.8 mm，右1.5 mm，深3.5 mm)；用配有合适大小钻头的电钻由标记点钻开颅骨至硬脑膜，用微量注射器针尖缓慢刺破硬脑膜，缓慢下降至3.5 mm，停置2 min后缓缓注药，观察48 h后脑组织标本做相关检测。

1.2.3 大鼠皮层缺血半暗带苏木素-伊红(HE)染色[15]

将石蜡切片脱蜡至水，苏木素液染核10～15 min，自来水冲洗片刻，用1%盐酸酒精分化0.5～1 min，流水冲洗片刻至数小时后用碳酸锂饱和水溶液反蓝1 min，再次流水冲洗15 min至数小时；用0.5%伊红水溶液复染2～5 min。逐级脱水、透明，晾干后中性树胶封片，在显微镜下观察并拍照。

1.2.4 大鼠脑片TTC染色[16]

配制2%TTC染液，将大鼠大脑从前至后均匀切成8片，每片厚度约2 mm；向培养皿中倒入2%TTC染液，使其浸没脑组织并放入37 ℃恒温箱中反应15～30 min；用生理盐水将着色好的脑片清洗一遍，倒入4%多聚甲醛至浸没脑片，并于4 ℃冰箱过夜；用生理盐水将脑片再次清洗一遍，将脑片按照前后次序依次排列在透明玻璃板上，然后置于扫描仪中进行正反两面扫描，保存图像；用Image J软件来处理计算脑缺血面积。TTC染料使脑片中梗死缺氧部分失染呈白色，未缺氧组织显示红色。脑缺血面积用各层脑片前后TTC失染区的均值之和/所有脑片全脑面积之和来表示。

1.2.5 免疫荧光[17]检测LPA1表达水平

将石蜡切片脱蜡至水，EDTA缓冲液中微波修复；自然冷却后PBS洗3次，室温下3%过氧化氢溶液中孵育10 min；用5% BSA中封闭20 min；每张切片滴加50 μL稀释后的LPA1一抗(1∶200)覆盖组织，4 ℃过夜；每张切片滴加50～100 μL的抗兔荧光二抗(1∶20 000)，室温条件下避光孵育50 min～1 h；避光条件下PBS洗3次，每张切片滴加50～100 μL DAPI染核5 min。PBS洗3次，抗荧光淬灭剂封片，4 ℃避光保存，拍照。

1.2.6 免疫组化[18]检测Caspase-3表达水平

将石蜡切片脱蜡至水后，进行抗原微波修复；阻断内源性过氧化物酶，孵Caspase-3一抗(1∶2 000)，湿盒中4 ℃过夜；PBS洗涤玻片3次，滴加抗兔的二抗(1∶20 000)以覆盖组织，于室温下孵育50 min；之后进行DAB显色，待细胞染为棕黄色时蒸馏水迅速冲洗，终止显色；苏木素复染细胞核后脱水封片，中性树胶封片，显微镜下观察并拍照。

1.2.7 Western blotting[19]检测Caspase-3、p-Akt蛋白表达水平

按照1 000 μL RIPA/1g脑皮质组织的标准加入预冷的裂解液，用玻璃匀浆器在冰上裂解匀浆30 min，并置于冰上裂解30 min；4 ℃下14 000 r/min离心15 min；离心后取上清，留10 μL用于测定样品总蛋白水平，剩余上清分装到0.5 mL的离心管中，加入1/3体积的4×上样缓冲液煮沸10 min；制备SDS-PAGE凝胶，每孔上样蛋白20 μg，根据BCA测得的蛋白水平确定上样体积，电泳分离，聚偏二氟乙烯膜(PVDF)转膜90 min，使用TBST清洗PVDF膜后5%脱脂奶粉封闭，室温水平摇床1 h，再次清洗后用稀释的兔抗鼠一抗中(Caspase-3，1∶2 000；p-Akt，1∶500；GAPDH，1∶1 000)封闭，放置于4 ℃冰箱中孵育过夜；取出后复温30 min，TBST洗膜3次，洗膜后用抗兔荧光二抗(1∶20 000)室温孵育1 h，TBST洗膜3次，ECL显影，用Image J软件进行条带分析。

1.2.8 统计学处理

2 结 果

2.1 A、B 2组大鼠大脑皮层半暗带的HE染色及2组LPA1的表达水平

如图1，经过B组(MCAO组)的处理，大鼠大脑皮层缺血再灌注后大脑组织有明显的损伤，并且经过LPA1和Neun免疫双标发现LPA1在B组(MCAO组)大鼠脑缺血半暗带神经元上的表达水平较A组(假手术组)大鼠相应部位明显增高。

图1 a和b为A、B 2组大鼠大脑缺血半暗带HE染色(×400倍),与A组(假手术组)比较,B组(MCAO组)有明显的缺血再灌注损伤,表现为细胞肿胀,细胞溶解坏死;c和d为A、B 2组大鼠大脑缺血半暗带LPA1免疫荧光染色(×400倍);e和f为A、B 2组大鼠大脑皮层半暗带Neun免疫荧光染色(×400倍);经过图像融合得到g和h(×400倍),LPA1蛋白在B组大鼠脑缺血半暗带神经元上的表达水平较A组大鼠相应部位明显增高

2.2 C、D 2组TTC染色情况

如图2，C组(MCAO+溶剂组)和D组(MCAO+LPA1拮抗剂组)脑片均可见苍白失染的脑梗死区，而非缺血区脑组织被染成红色。与C组(MCAO+溶剂组)比较，D组(MCAO+LPA1拮抗剂组)脑梗死面积明显增大(P<0.05)。

图2 C组和D组脑片均可见苍白失染的脑梗死区,而非缺血区脑组织被染成红色 与C组(MCAO+溶剂组)比较,D组(MCAO+LPA1拮抗剂组)脑梗死面积明显增大*P<0.05

2.3 C、D 2组大鼠皮层缺血半暗带HE染色及Caspase-3的表达水平

HE染色显示，与C组(MCAO+溶剂组)比较，D组(MCAO+溶剂组)细胞肿胀更加明显，胞浆空泡区增大，细胞核固缩更加严重，细胞间隙增宽更明显；免疫组织化学染色显示，C组(MCAO+溶剂组)和D组(MCAO+溶剂组)大鼠脑缺血半暗带细胞胞浆和胞核中均可见染成棕色或棕褐色的物质(即Caspase-3)。与C组(MCAO+溶剂组)比较，D组(MCAO+溶剂组)脑缺血半暗带Caspase-3蛋白水平明显增高(图3)。

2.4 Western blot检测大鼠大脑皮层组织各分子的表达水平

与C组(MCAO+溶剂组)比较，D组(MCAO+LPA1拮抗剂组)大鼠脑健侧、半暗带、缺血核心区Caspase-3蛋白表达水平均显著升高(P<0.05)(图4)，p-Akt蛋白表达水平均明显降低(P<0.05)(图5)。

3 讨 论

本研究是在本课题组长期的工作基础之上进一步探讨LPA1的表达对大鼠局灶性缺血再灌注后神经元凋亡的影响，前期研究表明MCAO大鼠梗死区LPA1的mRNA表达水平明显高于假手术组。本研究通过免疫荧光验证了MCAO大鼠脑缺血半暗带LPA1蛋白水平明显高于对照组。另外，在应用LPA1受体拮抗剂后大鼠脑梗死面积较对照组明显增大，且凋亡蛋白Caspase-3蛋白水平明显增高；同时发现p-Akt蛋白水平明显降低，提示LPA1可能通过Akt信号通路发挥保护作用。

图3 a和b分别为C、D 2组的HE染色(×400倍),从图中可见D组(MCAO+LPA1拮抗剂组)细胞肿胀更加明显,胞浆空泡区增大,细胞核固缩更加严重,细胞间隙增宽更明显;c和d为C、D 2组Caspase-3免疫组织化学染色(×400倍),从图中可见与C组(MCAO+溶剂组)比较,D组(MCAO+LPA1拮抗剂组)脑缺血半暗带Caspase-3蛋白水平明显增高

图4 Western blot检测显示与C组(MCAO+溶剂组)比较,D组(MCAO+LPA1拮抗剂组)大鼠脑健侧、半暗带、缺血核心区Caspase-3蛋白表达水平均显著升高*P<0.05

图5 Western blot检测显示与C组(MCAO+溶剂组)比较,D组(MCAO+LPA1拮抗剂组)大鼠脑健侧、半暗带、缺血核心区p-Akt蛋白表达水平均显著降低*P<0.05

LPA1是溶血磷脂酸(LPA)受体家族中的一员，目前已有 6 种 G 蛋白偶联受体被定义为 LPA 的受体，分别命名为 LPA1-LPA6[20-23]。其中，LPA1可通过不同的信号机制参与缺氧过程。前期研究显示，在大鼠视网膜缺血模型中神经节细胞和视网膜内层上LPA1和LPA2表达水平上调，LPA信号传导增强，以此促进了缺氧条件下视网膜细胞的存活[24]。然而，在大鼠早产儿视网膜病变模型中得出相反的结论[25]，即当LPA1在视网膜组织中上调时LPA暴露或LPA1过表达会降低细胞生存力，而抑制或shRNA敲除LPA1对细胞存活有益。同时，也有研究表明对LPA1信号通路加以阻断后胎儿缺氧导致的皮层症状[26]也随之消失。结合本研究结果发现在大鼠MCAO模型中LPA1表达水平上调，而对MCAO大鼠给予LPA1拮抗剂后梗死面积明显增大，细胞肿胀更加明显，坏死更加严重，提示LPA1对大鼠缺血半暗带的细胞生存具有积极作用。

缺血性脑卒中是脑血流受阻、脑组织缺血缺氧所致的脑损伤，缺血性脑损伤是诱导神经细胞凋亡基因表达最强烈的刺激之一。Macmanus等[27]首先报道了大鼠脑缺血后半暗带出现大量的凋亡细胞，Caspase-3是细胞凋亡过程中最主要的终末剪切酶，其在细胞凋亡中起着不可替代的作用。在大鼠MCAO模型中发现当给予LPA1拮抗剂后Caspase-3的表达水平明显增高，反向提示LPA1抑制脑缺血再灌注后神经元的凋亡。

本研究观察到，给予LPA1拮抗剂后p-Akt表达水平明显降低。Akt信号通路广泛存在于各种细胞中，是膜受体信号向细胞内转导的重要途径，具有调节细胞增殖、分化、代谢、抗细胞凋亡、调节学习记忆能力等生物学作用。因此，本研究推测LPA1可能通过Akt信号通路对缺血再灌注后神经元发挥保护性作用。

综上所述，大鼠脑缺血再灌注后半暗带神经元上的LPA1蛋白表达水平上调，对缺血神经元起保护作用，并可能是通过Akt途径发挥效应的。因此，研究LPA1对缺血神经元的保护作用可以为脑梗死的治疗提供新的思路。但LPA1对缺血神经元的具体保护机制及如何增强这种保护机制，以改善脑梗死后神经功能缺损，仍需进一步探索。进一步来说，LPA对神经血管单元不同组分是由何种受体类型、通过何种信号途径、产生何种效应，都需进一步的深入研究。