超高液相色谱法同时测定通宣理肺丸中白花前胡甲素和白花前胡乙素

陈少萍 王丽丽 梁艺坚

摘要：目的 建立通宣理肺丸中白花前胡甲素和白花前胡乙素的含量测定方法。方法 采用超高液相色谱法，色谱柱为ACE UItraCore SuperC18（75 mm×2.1 mm，2.5 ?m），流动相为甲醇-水，梯度洗脱，流速为0.3 mL/min，检测波长为321 nm，柱温为40 ℃。结果 白花前胡甲素、白花前胡乙素分别在20.48～204.8 ng（r=0.999 7）、5.158～51.58 ng（r=1.000 0）范围内呈良好线性关系，加样回收率分别为98.2%、100.3%。结论 该方法简便、快速、准确、重复性好，可用于通宣理肺丸中白花前胡甲素和白花前胡乙素的含量测定。

关键词：白花前胡甲素；白花前胡乙素；通宣理肺丸；超高液相色谱法

DOI：10.3969/j.issn.1005-5304.2018.09.018

中图分类号：R284.1 文献标识码：A 文章编号：1005-5304（2018）09-0076-03

Abstract： Objective To establish a method for content determination of praeruptorin A and praeruptorin B in Tongxuan Lifei Pills. Methods UPLC method was adopted. ACE UItraCore SuperC18 （75 mm × 2.1 mm， 2.5 μm） was used with methanol-water as the mobile phase， by gradient elute. The flow rate was 0.3 mL/min； The detection wavelength was set at 321 nm； The column temperature was 40 ℃. Results Praeruptorin A and praeruptorin B showed the good linear relationship in the range of 20.48–204.8 ng （r=0.999 7） and 5.158–51.58 ng （r=1.000 0）， respectively. The average recoveries were 98.2% and 100.3%， respectively. Conclusion The method is simple， fast， accurate and reproducible， which can be used to determine the contents of praeruptorin A and praeruptorin B in Tongxuan Lifei Pills.

Keywords： praeruptorin A； praeruptorin B； Tongxuan Lifei Pills； UPLC

通宣理肺丸由紫蘇叶、前胡、桔梗等11味药组成，具有解表散寒、宣肺止嗽功效，用于风寒束表、肺气不宣所致感冒咳嗽，症见发热、恶寒、咳嗽、鼻塞流涕、头痛、无汗、肢体酸痛[1]1452。前胡为方中臣药，具降气化痰、散风清热之功效，用于痰热喘满咯痰黄稠、风热咳嗽痰多[1]265。前胡的主要成分为香豆素类化合物，白花前胡甲素和白花前胡乙素是前胡的有效成分。已有文献报道通宣理肺丸中陈皮、枳壳、黄芩、苦杏仁、甘草等含量测定方法[2-7]，而对方中前胡的测定尚无报道。2015年版《中华人民共和国药典》前胡的含量测定采用三氯甲烷提取白花前胡甲素和白花前胡乙素，而三氯甲烷毒性较大，在新版药典中逐步采用其他溶剂替换。本研究建立甲醇提取、中性氧化铝柱净化测定通宣理肺丸中白花前胡甲素和白花前胡乙素含量的方法，以提升通宣理肺丸的质量标准，改进该制剂的质量控制方法。

1 仪器与试药

Agilent 1290高效液相色谱仪（美国安捷伦公司），KM-1990QFY智能型液晶数控型超声波清洗机（威固特新型设备有限公司），GR-202电子分析天平（日本A&D;公司）。

白花前胡甲素对照品（批号111711-200602，质量分数100%）、白花前胡乙素对照品（批号111904- 201102，质量分数98.8%），中国食品药品检定研究院；通宣理肺丸（批号151102、161101、161102），广西梧州三鹤药业股份有限公司；中性氧化铝（批号20140401），江苏强盛功能化学股份有限公司；甲醇为色谱纯，水为超纯水，其余试剂均为分析纯。

2 方法与结果

2.1 色谱条件与系统适用性试验

采用ACE UItraCore SuperC18色谱柱（75 mm×2.1 mm，2.5 ?m），流动相为甲醇-水，梯度洗脱（0～5 min，40%～60%甲醇；5～5.3 min，60%甲醇；5.3～6 min，60%～70%甲醇），流速0.3 mL/min，检测波长321 nm，柱温40 ℃，进样量2 ?L。

分别取混合对照品溶液、供试品溶液、阴性对照溶液，注入液相色谱仪，理论塔板数以白花前胡甲素计不低于5000，白花前胡甲素和白花前胡乙素与其他组分色谱峰分离度均大于1.5，阴性对照不干扰样品测定。色谱图见图1。

2.2 溶液的制备

2.2.1 对照品溶液的制备

分别精密称取白花前胡甲素、白花前胡乙素对照品适量，加甲醇溶解并定容，制成浓度分别为2.048、0.412 6 mg/mL的对照品贮备液，分别精密吸取白花前胡甲素对照品贮备液0.2 mL、白花前胡乙素对照品贮备液0.25 mL置于10 mL量瓶中，制得混合对照品溶液（白花前胡甲素40.96 ?g/mL、白花前胡乙素10.315 ?g/mL）。

2.2.2 供试品溶液的制备

取本品装量差异下的大蜜丸，剪碎，混匀，取24.0 g，加入硅藻土12.0 g，研匀，粉碎成粗粉，取13.5 g，精密称定，置于具塞锥形瓶中，精密加入50 mL甲醇，密塞，称定质量，超声处理（功率300 W，频率25 kHz）40 min，放冷，再称定质量，用甲醇补足减失的质量，摇匀，过滤，精密量取续滤液5 mL，加在中性氧化铝柱（100～200目，5 g，内径为1 cm）上，用正己烷30 mL洗脱，收集流出液及洗脱液，蒸干，残渣加甲醇溶解，并转移至5 mL量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，即得。

2.2.3 阴性对照溶液的制备

按处方配比，制备不含前胡的阴性样品，按“2.2.2”项下方法制成阴性对照溶液。

2.3 线性关系考察

分别精密吸取混合对照品溶液0.5、1、2、3、4、5 ?L注入液相色谱仪，按“2.1”项下色谱条件测定，以对照品浓度（ng）为横坐标，峰面积为纵坐标，绘制标准曲线，并计算回归方程。白花前胡甲素：Y=16.200 2X-4.9（r=0.999 7）；白花前胡乙素：Y=14.716X-1.16（r=1.000 0）。白花前胡甲素和白花前胡乙素分别在20.48～204.8 ng和5.158～51.58 ng范围内呈良好的线性关系。

2.4 精密度试验

精密吸取混合对照品溶液，连续进样6次，每次2 ?L，按“2.1”项下色谱条件测定其峰面积，结果白花前胡甲素、白花前胡乙素RSD分别为0.22%、0.20%，表明仪器精密度良好。

2.5 重复性试验

取同一批号（161102）样品，按“2.2.2”项下方法平行制备供试品溶液6份，按“2.1”项下色谱条件进样测定，记录峰面积，计算白花前胡甲素、白花前胡乙素的含量，结果二者的平均含量分别为0.232、0.063 mg/g，RSD分别为0.25%、0.67%。表明本方法重复性良好。

2.6 稳定性试验

取同一供试品溶液，分别于0、2、4、8、12、24 h按“2.1”项下色谱条件测定，记录峰面积，结果白花前胡甲素、白花前胡乙素的RSD分别为0.40%、0.70%，表明供试品溶液在24 h内稳定。

2.7 加样回收率试验

取同一批号（161102）样品6份，每份6.75 g，精密称定，置于具塞锥形瓶中，分别精密加入白花前胡甲素对照品贮备液0.6 mL、白花前胡乙素对照品贮备液0.7 mL，按“2.2.2”項下方法制备供试品溶液，按“2.1”项下色谱条件测定，记录峰面积，计算回收率，结果见表1、表2。

2.8 样品含量测定

取不同批号的3批样品，每批3份，按“2.2.2”项下方法制备供试品溶液，按“2.1”项下色谱条件测定，记录峰面积，计算含量，结果见表3。

3 讨论

白花前胡甲素和白花前胡乙素为香豆素类化合物，可溶于热水、甲醇、三氯甲烷、二氯甲烷、乙酸乙酯等有机溶剂。考虑到本品为丸剂，水提含糖杂质较多，三氯甲烷毒性较大，故本试验考察了以甲醇、二氯甲烷、乙酸乙酯为提取溶剂的提取效果，结果以甲醇为溶剂的提取率最高，故提取溶剂选择甲醇。

本试验考察了超声、回流和索氏提取3种提取方式，结果超声45 min、回流2 h和索氏提取3 h的提取效率无明显差异，由于超声简便、易操作，故选择超声提取。同时，对超声提取时间（30、45、60 min）和提取溶剂用量（25、50、100 mL）进行了考察，结果显示，加入甲醇50 mL、超声提取45 min可将样品中白花前胡甲素和白花前胡乙素提取完全。

本试验采用中性氧化铝柱净化，考察了洗脱溶剂的种类（甲醇、乙酸乙酯、正己烷）和用量，结果采用甲醇、乙酸乙酯、正己烷除杂待测成分均能洗脱完全，但2 min之前的杂质峰响应依次降低，杂质峰降低对基线的影响较小，定量更准确，因此选择正己烷30 mL洗脱。

本试验采用二极管阵列检测器在200～400 nm波长范围内对白花前胡甲素和白花前胡乙素进行扫描，结果显示，二者在254、321 nm均有最大吸收，254 nm处基线噪音较大，干扰待测成分的检测，而321 nm处基线平稳，灵敏度高，故选择321 nm为检测波长。

《中华人民共和国药典》曾将前胡和紫花前胡均收载为前胡使用，2005年版前胡项下删掉了紫花前胡的植物来源，2010年版起将二者分别收载，紫花前胡的指标成分为紫花前胡苷，应避免与前胡混用。本研究建立了前胡特征成分的检测方法，能有效控制通宣理肺丸制剂中前胡的质量。

参考文献：

[1] 国家药典委员会.中华人民共和国药典：一部[M].北京：中国医药科技出版社，2015.

[2] 陈英民.HPLC法测定通宣理肺丸中橙皮苷、柚皮苷含量[J].亚太传统医药，2014，10（14）：31-32.

[3] 周军，王杰，蔡霞.高效液相色谱法快速测定通宣理肺浓缩丸中6种成分的含量[J].中国药学杂志，2013，48（21）：1856-1859.

[4] 李玉琴，陈磊.高效液相色谱法同时测定通宣理肺丸中橙皮苷、柚皮苷的含量[J].中国医院药学杂志，2011，31（23）：1978-1980.

[5] 黄淑彰.HPLC法测定通宣理肺丸中黄芩苷的含量[J].中国药师，2005， 8（7）：555-557.

[6] 陈丽华，魏惠珍，饶毅，等.通宣理肺丸中苦杏仁苷的HPLC测定[J].江西中医学院学报，2005，17（5）：39.

[7] 郑广东.HPLC法同时测定通宣理肺丸中柚皮苷、橙皮苷及黄芩苷的含量[J].海峡药学，2007，19（12）：43-45.

（收稿日期：2017-12-10）

（修回日期：2018-01-16；编辑：陈静）