EMS诱变对蒙古国黄花苜蓿种子萌发和幼苗生长的影响

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(1.内蒙古自治区农牧业科学院， 呼和浩特 010031；2.中国科学院内蒙古草业研究中心， 呼和浩特 010031；3.卓资县农牧业局， 内蒙古 乌兰察布 012300)

化学诱变育种始于20世纪初，是通过诱变剂使植物产生可遗传突变，结合育种目标，通过对突变体进行选择和鉴定，育成遗传稳定的品系或品种[1-2]。此方法具有快速和高效的特点，已成为近几年来应用最为广泛的诱变技术。化学诱变剂约有上千种，其中甲基磺酸乙酯(EMS)由于诱变成本低、特异性强、频率高、范围广等特点，成为公认的应用最广、效果最好的化学诱变剂[3-4]。目前，在拟南芥[5]、小麦[6-7]、大麦[8]、水稻[9]、大豆[10]、玉米[11-12]、油菜[13]等作物中利用EMS诱变技术构建了突变体库。这些突变体库，不仅为深入研究基因组学提供了优良的材料，也为培育新品种提供了丰富的遗传资源。

表1 不同EMS浓度及不同处理时间对黄花苜蓿种子萌发的影响

EMS浓度(%) 处理18h 处理24h 发芽率(%)发芽势(%)发芽率(%)发芽势(%)ck98.00±0.82a94.50±1.68a94.00±2.16a92.00±2.94a0.496.00±1.41a89.63±2.22a94.00±1.83a92.00±2.16a0.691.00±1.29b84.00±2.16b89.50±0.96b82.00±2.94b0.886.50±0.96c74.00±3.16c76.50±1.71c45.00±2.38c1.075.50±0.96d43.50±3.30d54.00±0.82d31.50±0.50d1.255.00±0.58e34.50±0.96de48.50±0.50e30.00±0.00de1.447.50±0.96f32.50±1.25e38.50±0.96f25.00±0.58ef1.643.00±1.29g32.50±0.96e33.50±0.96g22.00±0.00f1.833.50±0.96h29.50±1.71f28.50±1.50h23.00±2.38f2.024.00±1.41i15.00±1.00g21.00±1.29i15.50±0.50g

注：不同小写字母表示处理间差异显著(p<0.05)。

苜蓿属是重要的豆科牧草，生态类型丰富，因此，在诱变育种研究上也受到了学者们的重视。国内外学者利用EMS诱变技术进行了苜蓿突变体库的构建和新品系的培育[14-20]。苜蓿诱变育种的研究不仅丰富了苜蓿的基因源，也为苜蓿育种提供了基础研究材料。黄花苜蓿(MedicagofalcataL.)是具有重要价值的豆科牧草，具有较强的抗寒、抗旱、耐瘠薄等特点。但黄花苜蓿的草产量较低，在生产中直接利用较少。因此，进行黄花苜蓿种质创新尤为重要。本研究以蒙古国黄花苜蓿种子为材料，分析EMS 不同处理浓度对黄花苜蓿种子萌发的影响，从而获得适宜的诱变剂量，为构建蒙古国黄花苜蓿突变群体奠定基础。

1 材料与方法

1.1 供试材料及试剂

供试材料为蒙古国黄花苜蓿种子。试验用EMS(甲基磺酸乙酯)购自Sigma公司。

1.2 试验地点

试验在内蒙古农业大学重点实验室完成。

1.3 诱变处理

精选蒙古国黄花苜蓿种子，用磷酸缓冲液(100 mmol/L，pH=7.0)配置浓度分别为0，0.4%，0.6%，0.8%，1.0%，1.2%，1.4%，1.6%，1.8%，2.0%(v/v)的EMS溶液，使用不同浓度的EMS溶液在20 ℃，在120 r/min的摇床中分别处理种子18 h和24 h，处理完后在流水下冲洗4 h，以去除残留的EMS。

1.4 发芽试验

分别对不同浓度，不同处理时间下的种子采用纸上发芽进行萌发试验，每个处理4次重复，每个重复50粒种子。25 ℃培养箱中培养，期间每天统计发芽数，共统计14 d。第4天各处理随机取10个幼苗利用游标卡尺测定幼苗总长度。根据发芽数和幼苗的生长情况，分析诱变蒙古国黄花苜蓿种子的适宜剂量。

发芽势(%)=(4 d内发芽种子数/供试种子总数)×100%;

发芽率(%)=(供试种子的发芽数/供试种子总数)×100%。

1.5 数据处理

试验数据采用Excel软件进行均值和标准误差的计算及制图，SAS数据处理软件进行方差分析。

2 结果与分析

2.1 EMS处理对蒙古国黄花苜蓿种子萌发的影响

EMS对黄花苜蓿种子的萌发具有较强的抑制效果(表1)。当EMS诱变时间一定时，随着EMS处理浓度的增加，黄花苜蓿种子的发芽势和发芽率均呈降低趋势。EMS诱变处理18 h时，0.4% EMS处理种子发芽势和发芽率分别为88.50%和96.00%，与对照无显著差异(p>0.05)而随着处理浓度的增加，发芽势和发芽率均显著降低，当处理浓度达到1.4%时，种子的发芽率为47.50%，降幅50.50%，浓度为2.0%时，发芽率仅为24.00%，降幅72.00%；EMS诱变处理24 h时，随着处理浓度的增加，发芽势和发芽率均呈下降趋势，当处理浓度为1.2%时，发芽率为48.50%，降幅45.50%，处理浓度为2.0%时，发芽率仅为21.00%，降幅73.00%。对于诱变时间，由表1可以看出，在同一EMS浓度下，黄花苜蓿种子发芽势和发芽率均随诱变时间延长而逐渐降低，说明诱导时间对发芽势和发芽率的影响比较显著。

2.2 EMS处理对蒙古国黄花苜蓿种子发芽进程的影响

EMS诱变处理延迟了黄花苜蓿种子的发芽进程(图1，图2)。与对照(ck)相比，18 h和24 h处理下的黄花苜蓿种子，除0.4%外，发芽高峰期均有所延迟，发芽整齐度降低。不同浓度的EMS处理种子18 h，发芽高峰期延迟2～5 d，发芽速率明显减慢，随着EMS浓度的增加，发芽时间逐渐延长；不同浓度下EMS处理种子24 h，发芽高峰期延迟2～4 d，发芽速率也明显减慢，发芽时间逐渐延长。

图1 EMS处理18 h对黄花苜蓿种子萌发的影响

图2 EMS处理24 h对黄花苜蓿种子萌发的影响

2.3 EMS处理对黄花苜蓿幼苗生长的影响

EMS浸种对黄花苜蓿的幼苗生长有明显抑制作用。如图3、图4所示，种子在不同EMS浓度下处理18 h和处理24 h后，幼苗的生长情况产生明显的变化，随着EMS处理浓度的升高，幼苗生长逐渐被抑制。处理18 h的种子，在EMS浓度达到1.0%时，幼苗高度与对照无显著差异，当EMS浓度达到1.2%时，幼苗高度由对照的5.19 cm降低到4.27 cm，浓度为2.0%时，幼苗高度仅为3.14 cm，均与对照差异显著(p<0.05)。处理24 h的种子，在EMS浓度达到0.8%时，幼苗长势与对照无显著差异，当EMS浓度达到1.0%时，幼苗高度由对照的5.15 cm降低到3.38 cm，浓度为2.0%时幼苗高度仅为2.79 cm，均与对照差异显著(p<0.05)。

注：不同小写字母表示处理间差异显著(p<0.05)。图3 EMS处理18 h对黄花苜蓿幼苗生长的影响

图4 EMS处理24 h对黄花苜蓿幼苗生长的影响

3 讨论与结论

EMS诱变对黄花苜蓿种子发芽影响的分析结果显示，在2个处理时间下，随着EMS浓度的增加，种子的发芽率、发芽势及幼苗长度均呈递减趋势，浓度越高，递减趋势越明显，并且种子出现不同程度的腐烂，由此说明高浓度的EMS对种子的萌发和幼苗的生长具有显著的抑制作用，并且对种子具有致死作用。这一现象与霍雅馨[17]在对甘农3号紫花苜蓿种子进行诱变时得出的结论相似，种子发芽率降低，幼苗生长被抑制。与对照(ck)相比，经过EMS处理的种子发芽不整齐，种子的初始萌发时间被延迟，由此说明EMS 处理在一定程度上对黄花苜蓿种子发芽初始时间和发芽进程均具有延迟作用。

利用EMS进行诱变育种，诱变的适宜条件很关键。不同植物间或同一物种的不同品种间以及同一植物的不同材料对诱变剂的敏感性是不同的。所以，最终的适宜诱变浓度也不同。因此，根据不同试验材料，选择适宜的浓度十分重要。在苜蓿的EMS诱变研究中，霍雅馨研究得出，EMS对紫花苜蓿的适宜诱变剂量为0.8%，诱变时间18 h[17]，而吴兴兰等研究认为，最适紫花苜蓿的EMS诱变半致死剂量为1.6%，处理时间为8 h[21]。本试验中，根据发芽率结合幼苗长度综合分析，认为EMS对黄花苜蓿的适宜诱变时间和剂量分别为18 h和1.4%，与上述苜蓿的最佳诱变浓度存在差异，推测可能是材料不同导致。