3种人参属药用植物种子生根过程中胚乳营养物质与酶活性的变化

2018-11-08英平

种子 2018年10期

关键词：胚乳胚根西洋参

，，，，英平

(中国农业科学院特产研究所，吉林长春 130112)

关键字：人参属药用植物；胚乳；营养物质；淀粉酶

图1 人参种子生根过程中的变化

图2 西洋参种子生根过程中的变化

人参(PanaxginsengC.A.Mey)、西洋参(P.quinquefoliusL.)、三七(P.notoginseng(Burk.)F.H.chen)是五加科多年生草本药用植物，播种是目前三者最常采用的栽培方式。人参、西洋参种子具有深度休眠特性，三七种子也至少需要2个月才能够完成后熟。因此，有关三者种子的研究，大多集中在如何解除种子休眠[1-2]，促进种子萌发方面[3]。目前对人参、西洋参、三七种子生根过程中胚乳中营养成分的变化还未见报道。种子在发芽的过程中需要不断吸收胚乳中的营养物质，为种子的呼吸提供能量，为新物质的合成提供必要的成分。本研究测定了三者种子生根过程中蔗糖、可溶性总糖、淀粉和可溶性蛋白含量和淀粉酶活性的动态变化，为人参、西洋参、三七种子在生根过程中的物质代谢的基本规律提供基础研究。

1 材料与方法

1.1 供试材料

本试验所用的人参、西洋参裂口种子于2017年4月购自吉林抚松，三七种子于2017年11月购自云南文山，新鲜果实洗去果肉后15 ℃沙藏50 d，完成形态后熟和生理后熟。选取大小一致、饱满的种子播种于蒸馏水湿润过的2层滤纸上，放入培养箱内，设置温度为20 ℃，保持滤纸湿润。取未萌发、露白阶段、胚根伸长至2，5，8 mm的种子，剥取胚乳，按照不同的生根阶段装进相应的离心管中待用。

1.2 蔗糖含量测定

蔗糖含量采用UPLC-ELSD法测定[4]，每组实验设3次生物学重复。

1.2.1 色谱条件

色谱柱：ACQUITY UPLC BEH Amide(2.1×100 mm，1.7μm)；流动相：0.2%TEA乙腈-水(梯度洗脱：0～2 min，85%～78%乙腈；2～7 min，78%～68%乙腈)；流速：0.2 mL/min；柱温：50 ℃，进样量2μL。

1.2.2 对照品溶液制备

精密称取蔗糖标准品0.400 0 g，置于100 mL容量瓶中，加入50%甲醇配置成浓度为4.000 mg/mL的对照品溶液。

1.2.3 供试品溶液制备

取人参种子胚乳于50 ℃烘干至恒重，研成粉末，准确称取样品0.100 0 g置于15 mL离心管中，加入10 mL蒸馏水，室温超声提取30 min(功率500 W，频率40 kHz)，静置过夜，吸取上清液1 mL，10 000 r/min离心10 min，过0.22μm PTFE滤膜，在“1.2.1”色谱条件下进样。

1.2.4 标准曲线的制备

精密量取蔗糖对照品溶液0.5，1.0，1.5，2.0，4 mL于20 mL容量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，按照上述色谱条件进行测定峰面积。以峰面积为纵坐标(y)，浓度为横坐标(x)绘制标准曲线，得回归方程为y=1.35x+6.92，r=0.997，线性范围0.039 7～0.199 mg/mL。

1.3 可溶性总糖、淀粉、淀粉酶和可溶性蛋白含量的测定

可溶性总糖和淀粉含量测定采用蒽酮比色法[5]，可溶性蛋白质含量测定采用考马斯亮蓝法[6]，淀粉酶活力测定采用3, 5-二硝基水扬酸还原法[5]，每组实验设3次生物学重复。

1.4 数据统计分析

用Excel 2010软件作图，SAS 9.2统计软件进行差异显著性分析。

2 结果与分析

2.1 生根过程的变化

图1、图2、图3分别为人参、西洋参、三七种子未萌发、露白阶段到胚根伸长至2，5，8 mm时种子及种胚形态的变化图。

图3 三七种子生根过程中的变化

2.2 蔗糖含量的变化

未萌发时人参、西洋参、三七种子的蔗糖含量分别为1.30%、0.78%、0.52%(DW)，萌发后急剧下降。生根过程中呈现先增加后下降的趋势，当胚根长为2 mm时，分别达到最大值1.45%、0.80%、0.37%(DW)，随后不断下降(图4)，这可能是由于淀粉等多糖在水解酶的作用下水解为蔗糖而出现了短暂的积累而显著增加，后期又在蔗糖酶的作用下水解为能被直接利用的小分子糖，为种子的呼吸提供底物，从而使蔗糖含量显著下降。

图4 人参、西洋参、三七种子生根过程中蔗糖含量的变化

2.3 可溶性总糖含量的变化

在未萌发时，人参、西洋参、三七种子胚乳中的可溶性总糖含量分别为6.14%、4.80%、3.93%(FW)，露白阶段下降至4.16%、3.71%、2.84%(FW)，呈显著性差异(图5)。随着胚根长度的伸长，人参、西洋参、三七种子胚乳中的可溶性总糖含量逐渐下降，胚根长为8 mm时胚乳中的可溶性总糖含量分别显著下降至2.27%、2.57%、1.71%(FW)，可溶性总糖含量的下降也与种子的呼吸作用不断增强有关。

图5 人参、西洋参、三七种子生根过程中胚乳可溶性总糖含量变化

2.4 淀粉含量的变化

未萌发时，人参、西洋参、三七种子胚乳中的淀粉含量分别为4.31%、3.38%、2.43%(FW)，在种子的生根过程中人参、西洋参、三七种子胚乳中的淀粉含量均呈显著下降趋势(图6)。在这个过程中，人参种子胚乳中的淀粉消耗最多为2.31%，西洋参种子胚乳中的淀粉含量下降了1.06%，而三七种子胚乳中的淀粉含量仅减少了0.65%。胚乳中的淀粉被分解为小分子糖，转化或合成新的物质。淀粉含量在种子胚根伸长的过程中不断降低，也说明淀粉在种子生根过程中作为主要的营养物质被分解。

图6 人参、西洋参、三七种子生根过程中胚乳淀粉含量变化

2.5 可溶性蛋白质含量的变化

在种子生根过程中，人参、三七种子胚乳中的可溶性蛋白含量胚根伸长至2 mm时没有显著性变化，当胚根长为5 mm时显著下降至0.84%和0.63%(FW)(图7)，而西洋参种子胚乳中的可溶性蛋白含量在生根过程中呈显著性下降趋势，减少了0.33%(FW)。人参、三七种子胚乳中的可溶性蛋白含量分别下降了0.37%和0.20%(FW)。胚根持续伸长需要更多的物质合成新的结构蛋白质和功能蛋白质，胚乳中的贮藏蛋白不断降解为溶解状态的氨基酸转运到胚根部分从而使胚乳中的蛋白含量降低。

图7 人参、西洋参、三七种子生根过程中胚乳可溶性蛋白质含量变化

2.6 淀粉酶活性的变化

2.6.1 人参淀粉酶活性的变化

由图8可知，人参种子在生根过程中，胚乳中的α-淀粉酶活性先上升后下降，在胚根伸长至5 mm时达到最大值3.14 mg/(g·min)，随后活性开始降低。β-淀粉酶活性则在生根期间呈显著降低趋势，在胚根伸长至8 mm时迅速上升为14.08 mg/(g·min)。总淀粉酶活性的变化趋势与β-淀粉酶活性变化一致。

图8 人参种子生根过程中胚乳淀粉酶活性的变化

2.6.2 西洋参淀粉酶活性的变化

由图9可知，随着西洋参种子的萌发，胚乳中的α-淀粉酶活性开始缓慢增加，在胚根伸长至5 mm时达到最大值1.98 mg/(g·min)，随后下降。β-淀粉酶活性先缓慢下降，在胚根伸长至8 mm时迅速上升为7.46 mg/(g·min)。这个过程中西洋参种子胚乳内的β-淀粉酶活性下降幅度较人参小，总淀粉酶活性的变化趋势与β-淀粉酶活性变化一致。

2.6.3 三七淀粉酶活性的变化

由图10可以看出，三七种子胚乳中的α-淀粉酶活性并无显著性变化，β-淀粉酶活性先缓慢升高为7.72 mg/(g·min)，在胚根长为8 mm时迅速下降。总淀粉酶活性在胚根长为2 mm时上升至最大值10.50 mg/(g·min)，随后显著下降。

图9 西洋参种子生根过程中胚乳淀粉酶活性的变化

图10 三七种子生根过程中胚乳淀粉酶活性的变化

3 讨论

胚乳中的可溶性总糖在人参、西洋参、三七种子生根过程中不断下降，不仅为种胚的生长提供能量和中间物质[7]，还为种子的呼吸作用提供底物，为细胞和细胞器的合成提供结构物质，从而导致可溶性总糖含量降低，这与赵玉锦等[8]的研究相似，而王延琴[9]、王建波[10]等的研究表明，种子在萌发过程中可溶性总糖含量的变化趋势是先升后降，这与本研究的结果不一致，可能可溶性总糖先于淀粉被利用，淀粉的转化速度慢于可溶性总糖利用的速度，使得可溶性总糖呈显著下降趋势。

大分子糖类化合物在水解酶的作用下水解为蔗糖而出现了短暂的积累而增加，后期在蔗糖酶的作用下水解为能被直接利用的小分子糖，为种子的呼吸提供底物，从而使蔗糖含量下降，这与黄升谋等[11]的研究相似。种子内的碳源主要以淀粉的形式贮藏在胚乳当中，在种子生根过程中随着种子呼吸作用的增强，淀粉在淀粉酶的作用下不断由大分子糖水解为能被利用的小分子可溶性糖和其他碳水化合物，为胚根的生长提供物质和能量[12]。

人参、西洋参种子在萌发前淀粉在淀粉酶的作用下水解为可溶性糖等物质为萌发提供动力，因此萌发前β-淀粉酶的含量较高。萌发后淀粉含量的迅速减少导致β-淀粉酶活性的短暂降低，当胚根生长至8 mm时，β-淀粉酶活性再次显著升高，表明此时的种子进入了下一个时段需要大量分解贮藏物质供应胚根和胚芽的生长。在浦梅的研究中，滇重楼种子萌发后，β-淀粉酶活性先降低，在胚根伸长至1.5 cm时继而又上升至极大值[13]，这与本研究结果一致。三七种子β-淀粉酶活性在生根过程中先升高后降低，与人参、西洋参不同的是三七种子在萌发生长的过程中淀粉含量并未有大幅度的减少，β-淀粉酶活性的缓慢升高不断促进着淀粉的水解，这与沈超等[14]的研究结果一致。

在这3种人参属药用植物种子生根过程中，胚乳中的贮藏蛋白在蛋白酶的作用下不断降解为多肽、二肽或者是溶解状态的氨基酸[15]转运到胚根部分，合成新的蛋白质，这个过程所释放的能量可用于物质运输、细胞的生长和分化。在碳水化合物之间相互转化的过程中淀粉酶、蔗糖酶以及相关性酶的变化，贮藏蛋白质降解的顺序与相关蛋白酶的变化还有待于利用蛋白质组学等方法做进一步的研究。