阿司匹林对T2DM小鼠药效作用的研究

高华山，代红梅，佟伟霜

（平顶山学院，河南平顶山 467000）

糖尿病是引起阿司匹林抵抗（AR）最主要的因素。根据大量临床治疗显示，糖尿病与AR有着非常密切的关系，与非糖尿病患者相比，糖尿病患者出现AR的概率明显更高[1]。另有研究显示，在糖尿病患者机体中血小板活性有显著升高，导致其出现心血管的发病率较之普通人群高出了2～4倍[2]。另有报道表示，在为糖尿病提供阿司匹林干预的过程中，与男性相比，女性出现AR的概率明显更高[3]。本研究在相关文献研究基础上，对2型糖尿病（T2DM）小鼠模型进行构建，通过对雌性与雄性小鼠周期性阿司匹林给药，对其与药效学相关的指标变化情况进行测定，旨在对糖尿病状态下AR的情况进行探讨，明确是否存在雌性、雄性差异。

1 材料与方法

1.1 动物与饲料

购入80只小鼠（8周龄，SPF级，C57BL/6J），其中雌性与雄性小鼠各40只，体重均为20～22 g。将80只小鼠分别关在10个笼子内，每笼各8只，动物在笼内自由摄入食物和饮水。高脂饲料（HFD）由笔者根据实验需要执行调配，主要由玉米淀粉、碳酸钙、复合维生素、猪油、大豆油和蔗糖等共同组合而成。

1.2 试剂与药品

总胆固醇（TC）、甘油三酯（TG）试剂盒（默沙克生物）、空腹血清胰岛素（FINS）、血栓素B2（TXB2）、6酮前列腺素F1a（6-keto-PGF1a）ELISA试剂盒（上海酶研生物科技）；白细胞介素6（IL-6）、白介素1β（IL-1β）酶联免疫吸附测定法（ELISA）试剂盒（上海康朗生物科技）；链脲佐菌素（STZ）、阿司匹林、柠檬酸、羧甲基纤维素钠（CMC-Na）等（南京化学试剂）；生理盐水（平顶山学院实验室）等。

1.3 仪器与设备

酸度计（HANNA，pH211型）、雅培便携血糖仪及其一次性血糖试纸、分析天平（AUW，120D）、超纯水器（Milli-Q Gradient A10）、酶标仪（Powerwave 200）、低温高速离心机（德国）等。

1.4 实验方法

1.4.1 建模

根据相关文献报道结果[4]，运用链脲佐菌素和高脂饲料诱导法（HFD/ST）完成T2DM动物模型建立。具体建模方法：取健康小鼠，对其进行持续7d适应性喂养，禁食12h后，采用乙醚行麻醉处理，进行眼底静脉丛取血，对其相关指标进行测定。随机选取20只小鼠，为其提供基础性饲料，并设定为正常对照组，另60只小鼠均在取血4d后，禁食12h，对其体质量进行称重，并经由腹腔为小鼠注射STZ（正常组注射缓冲盐溶液）完成高血糖模型的复制，所有小鼠均在30 min内完成所有注射。

1.4.2 分组与给药

完成腹腔注射后，继续为小鼠进行3周相应饲料的喂养。将20只正常饲料喂养小鼠随机分为正常组、正常+阿司匹林组，各组分别有小鼠10只，其中雌性和雄性小鼠各有5只，称重标号；另60只高脂喂养复合腹腔注射小剂量STZ的小鼠同样随机分为2型糖尿病模型组（模型组）、模型+阿司匹林组。以灌胃的方式为小鼠提供阿司匹林，给药剂量为每日13mg/kg（剂量根据70 kg成年人体表面积换算后得出），持续干预10d。

1.5 观察指标

对各组小鼠的情况进行密切观察，重点对其体重、状态、饮水量、摄食量等情况进行观察。在小鼠尾部进行采取，并对其空腹血糖进行测定，同时按照对其TC、FINS、IL-6、IL-1β水平进行测定，所有操作均严格按照试剂盒要求实施。取腹主动脉血500μL，按照流式细胞仪对其血小板CD629表达水平进行测定。取眼眶血0.5ml，按照反射免疫检测法对其血浆TXB2、6-keto-PGF1a进行测定。

1.6 统计学分析

运用统计学软件Stat View对数据进行统计分析，相关数据均以均数±标准差（x—±s）表示，并以运用Student’s t-test行组间差异检验。有显著差异采取双尾检验，P＜0.05即表示差异有统计学意义。

2 结果与分析

2.1 小鼠基本情况

模型组小鼠表现出明显的活动迟钝，精神萎靡不振，饮水量与食物摄入量均有明显增多，且尿量明显增加，需每日对垫料进行更换，体重增长明显。正常组小鼠精神状态较佳，尿量、食物摄入量以及体重均表现为平稳增加。在为两组小组提供阿司匹林干预后，均未观察到明显变化。

2.2 HFD/STZ诱导小鼠的体重、糖脂、胰岛素水平变化

正常组与模型组小鼠对比显示，两组FBG、FINS、TG、TC与BW均有显著差异，差异有统计学意义（P＜0.05），模型组的体重、糖脂指标与胰岛素水平与正常组比较均有显著升高，这表明本次T2DM模型成功，见表1。

2.3 HFD/STZ诱导小鼠的血清炎症因子变化

正常组与模型组小鼠对比显示，两组IL-6、IL-1β均有显著差异，差异有统计学意义（P＜0.05），模型组的IL-6、IL-1β水平与正常组比较均有显著升高。见表2。

表1 HFD/STZ诱导小鼠的体重、糖脂、胰岛素水平变化

表2 HFD/STZ诱导小鼠的血清炎症因子变化

2.4 阿司匹林对小鼠血小板CD62P的影响

阿司匹林未干预与干预10 d血小板CD62P表达检测结果分析结果见图1。根据图1来看，模型组雌性小鼠血小板CD62P显著高于正常组小鼠，且差异有统计学意义（P＜0.05），这表明在2型糖尿病状态下会致使雌性小鼠血小板CD62P活性增强。在为正常组小鼠实施阿司匹林干预后，雌性小鼠和雄性小鼠血小板CD62P均表现出下降（P＜0.05），这表明阿司匹林可有效控制血小板CD62P的活性。模型组小鼠在行阿司匹林干预后，其雄性小鼠的血小板CD62P也呈现为明显下降（P＜0.05），但雌性小鼠与干预前比较无差异（P＞0.05），这表明阿司匹林干预后雄性小鼠血小板CD62P活性得到控制，而雌性小鼠表现出AR。

2.5 阿司匹林对小鼠血浆TXB2/6-keto-PGF1a水平的影响

阿司匹林未干预与干预10 d血浆TXB2/6-keto-PGF1a表达检测结果分析见图2。根据图2来看，正常组雌性与雄性小鼠在行阿司匹林干预后，其血浆TXB2/6-keto-PGF1a均表现出下降，该结果与血小板CD62P检测结果一致。模型组小鼠在行阿司匹林干预后，其雄性小鼠的血浆TXB2/6-keto-PGF1a也呈现为明显下降（P＜0.05），但雌性小鼠在进行阿司匹林干预后，其表达出现了血浆TXB2/6-keto-PGF1a明显升高（P＜0.05）。这表明阿司匹林干预后可较好地达到对雄性小鼠的抗血小板干预效果，但在雌性小鼠上其药效学却出现了明显下降，故引起了相反的情况。

图1 阿司匹林未干预与干预10 d血小板CD62P表达检测结果分析

图2 阿司匹林未干预与干预10 d血浆TXB2/6-keto-PGF1a表达检测结果分析

3 讨论

本研究通过为小鼠提供小剂量STZ与高脂肪饮食，使得模型组小鼠表现出了明显的血糖升高、体重增加、血脂升高等糖代谢紊乱现象，同时其胰岛素水平也有显著增加，形成了胰岛素抵抗，这与以往研究报道[5]所构建的模型结果相同，且也符合T2DM的临床特征。血小板活化主要是受到前列腺素（PGI2）与血栓素（TXA2）之间比例的影响，其分别来源于血小板环氧合酶COX-1、血管内皮细胞COX-2，为此，本研究在对阿司匹林效应的评价中选取了TXB2/6-keto-PGF1a比值作为评价指标。CS62P是血小板后期活化阶段非常关键的特异性标志物，当血小板被激活之后，血小板表面膜与其细胞质中的a颗粒相互融合，从而促使大量CD62P被迅速释放，使其大量暴露在血小板表面。为此，通过该项指标的测定能够充分体现血小板的活化情况。本研究在采取HFD/STA行诱导建模后，模型组的小鼠其血小板表面CD62P表达水平出现了显著增加，特别是雌性小鼠尤其明显，而通过对小鼠实施阿司匹林用药干预后，正常组与模型组雄性小鼠均对阿司匹林表现出较好的药效学效应，而雌性小鼠的血小板CD62P与TXB2/6-keto-PGF1a表达均未出现其应用的下降，反而出现了升高，其中TXB2/6-keto-PGF1a表达有统计学差异（P＜0.05），该结果与以往的临床研究成果一致，与男性相比，女性更易发生AR[6]。但需要重视的是，在通过HFD/STA行诱导建模后，模型组的小鼠其血清IL-6、IL-1β水平均高于正常组，研究者表示[7]，糖尿病所表现出慢性炎症特征，与血管内皮COX-2升高密切相关，这就为下一步AR形成机制的探索提供了新的思路。