大孔树脂-结晶法精制蔓三七叶黄酮的集成技术研究

涂招秀，谢欣＊，胡居吾，黄斌华

（1.江西省科学院，江西南昌 330096；2.江西华紫仁农业开发有限公司，江西赣州 330000）

蔓三七，又名平卧菊三七、蛇接骨、续命草、神仙草，味辛、微苦、性凉，为多年生草本药食两用植物。蔓三七茎叶营养丰富，富含粗多糖和绿原酸，同时还含有总黄酮、维生素A、维生素C、氨基酸，富含有机钙等成分。民间利用其通经活络、消肿止痛、消炎止咳，治疗跌打损伤、支气管肺炎、肺结核等[1]。现代生物化学和医学研究证明，蔓三七具有通经活络、消炎止咳、散淤消肿、活血生肌等功效[2]；能延缓衰老、激活免疫细胞、改善机体免疫功能、提高人体免疫力，增强人体的新陈代谢并对记忆障碍有一定改善作用[3]；具有降血压、降血糖和预防慢性肾病、抑制乙型肝炎的显著效果[4]；对预防和治疗心脑血管疾病、糖尿病等有一定的疗效[5]；还具有抗病毒、抗菌活性、抑制骨髓癌和志贺样毒素细胞的活性[6]。

大孔吸附树脂是近几十年发展起来的一种具有多孔立体结构、人工合成的有机高分子新型分离材料[7]，其理化性质稳定，不溶于有机溶剂及酸碱，不受低分子化合物、无机盐类及强离子的干扰，吸附成效好，容易再生，使用周期长，被广泛用于分离纯化天然产物[8]。近年来，我国在使用大孔树脂对天然产物的分离、纯化工作已十分普遍[9-10]。

本试验以蔓三七叶为原料采用大孔吸附树脂-结晶法相结合的集成技术，从蔓三七叶中分离纯化得到含量高的蔓三七叶黄酮，为开发以蔓三七叶黄酮为主的药品及功能性食品提供重要理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

蔓三七叶，江西华紫仁农业开发有限公司，烘干、粉碎后过20目筛备用。

芦丁标准品，中药固体制剂制造技术国家工程研究中心；其余试剂均为国产分析纯。

大孔树脂D101、AB-8、S-8、NKA-9购于南开大学化工厂，HPD-100、HPD-300购于沧州宝恩化工有限公司，306型购于扬州制药有限公司；95%乙醇、乙酸乙酯、均为分析纯；吸附柱：60×800 mm，自制。

751型紫外分光光度计（上海第二分析仪器厂）；RE-52AA旋转蒸发器（北京医用离心机厂）；YZG-600真空干燥箱（瑞安金安制药机械有限公司）；AE163电子天平（余姚纪铭设备有限公司）。

1.2 实验方法

1.2.1 工艺流程

蔓三七叶→干燥→粉碎→过筛（20目）→动态超高压微射流均质辅助提取→过滤→滤液→上柱吸附→洗脱→减压回收乙醇→进一步浓缩→重结晶→真空干燥→蔓三七叶黄酮产品。

1.2.2 测定方法

精确称取在120 ℃干燥至恒重的芦丁对照品0.200 0 g，置于100 mL容量瓶中，加80%乙醇70 mL，置于水浴上微热使溶解，冷却至室温，加乙醇至刻度，摇匀。精密吸取10 mL，置于100 mL容量瓶中，加水至刻度，摇匀，即得0.2 mg/mL芦丁对照品溶液。精密量取对照品溶液0.0、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0 mL和7.0 mL，分别置25 mL容量瓶中，加乙醇6 mL，加入5%亚硝酸钠溶液1.0 mL，混匀，放置6 min，再加10%硝酸铝溶液1.0 mL，摇匀，放置6 min，后加5%氢氧化钠试液10.0 mL，再加水至刻度，摇匀，放置15 min。以乙醇为参比，用1 cm比色皿，于紫外可见分光光度计上，在400～600 nm波长处进行扫描。结果表明，对照品溶液在510 nm处有最大吸收，因此选择510 nm作为测定波长。在510 nm波长处测定体系的吸收度，以吸收度（A）为纵坐标、浓度为横坐标，绘制标准曲线。

1.2.3 树脂静态吸附实验[11]

1.2.3.1 树脂的预处理

用乙醇反复浸泡洗涤，直至乙醇洗出液透明无色，再依次用体积分数2%的盐酸和质量分数5%的氢氧化钠进行洗涤，最后用蒸馏水洗至中性。

1.2.3.2 静态吸附-解吸实验

称取1 g处理好的树脂置于250 mL的锥形瓶中，再量取同体积、同浓度的蔓三七叶黄酮提取液，加入装有树脂的锥形瓶中，恒温振荡24 h达吸附平衡，测吸附前后蔓三七叶黄酮溶液在510 nm处的吸光度值，并计算静态吸附率。将吸附实验过滤后的树脂置于250 mL的锥形瓶中，加入20 mL 70%乙醇作为洗脱剂，用玻璃纸封口后，置于摇床振荡（110 r/min；30 ℃）解吸，4 h后取出，抽滤，测定滤液中在510 nm处的吸光度值。吸附量(Q)公式如下：

其中，C0：原液中蔓三七叶黄酮浓度，mg/mL；C1：流出液中蔓三七叶黄酮浓度，mg/mL；V：吸附液体积，mL；W：干树脂重量，g。

解吸量(Q)公式如下：

式中，Q’：解吸率；C0：原液中蔓三七叶黄酮浓度，mg/mL；C1：流出液中蔓三七叶黄酮浓度，mg/mL；V1：为洗脱液体积，mL；V：吸附液体积，mL。

1.2.3.3 树脂动态吸附实验

以最佳树脂为吸附树脂，在室温下采用湿法将预处理好的树脂装入吸附柱中（树脂高30 cm，柱内径为3 cm），分别采用不同的流速将蔓三七叶黄酮提取液上柱吸附，分时间段收集流出液，直到流出液在440 nm处的吸光度值为粗提液的5%时，停止吸附，以选择适宜的吸附流速。

1.2.3.4 动态洗脱实验

先用2倍树脂体积的水或低浓度（10%左右）乙醇水溶液洗涤吸附了蔓三七叶黄酮的树脂，再分别用5倍树脂体积的不同浓度的乙醇水溶液对吸附饱和的吸附柱进行洗脱，测定洗脱液在510 nm处的吸光度值，确定适宜的洗脱溶剂浓度。

1.2.3.5 结晶实验

对洗脱液在真空条件进行回收乙醇和浓缩，再对其进行真空冷冰干燥，得蔓三七叶黄酮较纯产品，采用分光光度计法对其进行含量测定。取一定量的产品，用适量70 ℃温水进行溶解，后转入4 ℃冰箱中进行重结晶，静置12 h后，抽滤，滤饼，再按上述方法重结晶几次，最后的滤饼在真空下干燥，得蔓三七叶黄酮精品，采用分光光度计法对其进行含量测定。

2 结果和分析

2.1 蔓三七叶黄酮的最佳提取条件

以蔓三七叶为原料，研究动态超高压微射流技术对蔓三七叶中黄酮得率的影响。以单因素实验为基础，选取乙醇浓度、提取温度、提取时间、动态超高压微射流均质压力为主要因素进行研究，通过正交实验法优化蔓三七叶中黄酮的提取工艺。经正交实验法优化后蔓三七叶中黄酮提取的工艺条件为乙醇浓度80%、提取温度65 ℃、提取时间2.0 h、微射流均质压力80 MPa、微射流均质次数2次、液料比15 mg/mL、提取次数2次。此时，蔓三七叶黄酮的得率为1.95%。

本实验借助的动态超高压微射流技术是一种新兴的超微细化技术，它能对物料产生强烈剪切作用、高频振荡、高速撞击和压力瞬间释放等一系列的综合作用，从而导致物料的细胞或细胞壁破碎，从而使物料的活性成分溶出，与常规法相比较，具有提取时间短、蔓三七叶黄酮提取率高等优点，可以大大提高生产效率，而且不会影响物料中的活性成分。

2.2 各种树脂静态吸附性能的比较

采用上述提取液（浓度25.6 mg/mL）做各种树脂静态吸附性能的比较实验，结果见表1。对蔓三七叶黄酮静态吸附量较大的树脂为306型。

表1 各种树脂对蔓三七叶黄酮的吸附量、解吸率以及吸附的选择性

2.3 不同流速对吸附效果的影响

吸附流速影响溶质向树脂表面的扩散，从而决定吸附效果，如果流速太快，溶质分子来不及扩散到树脂内表面，就会发生漏过，造成样品流失。

采用提取液各300 mL以不同的流速通过吸附柱（树脂高30 cm，柱内径为3 cm），测流出液的吸光度值，如图1所示，吸附流速分别为1、2、3、4 mL/min和5 mL/min时，泄漏率对应为5.16%、6.57%、13.14%、20.47%和23.16%。此结果显示，吸附流速越大，蔓三七叶黄酮的泄漏越严重，但流速过慢则会延长生产周期，节约生产成本，从数据可知，当流速在1 mL/min和2 mL/min时，两者之间的泄漏率相差不大，从生产周期和生产成本上考虑，宜选择吸附流速2 mL/min为适。

图1 不同流速对泄漏率的影响

2.4 不同浓度洗脱剂对洗脱效果的影响

图2为不同浓度洗脱剂对回收率的影响，当乙醇浓度分别为30%、50%、70%、80%和90%时，蔓三七叶黄酮的回收率分别为52.35%、66.65%、90.86%、91.07%和91.91%，可见洗脱剂的浓度越高，回收率越高，但当洗脱剂浓度超过70 %以后，蔓三七叶黄酮已基本洗脱完全，再增大浓度对回收率影响不大，综合考虑成本等因素，选用70%的乙醇作为洗脱剂为宜。

图2 不同乙醇浓度洗脱剂对回收率的影响

2.5 洗脱液的浓缩及干燥

洗脱液在60 ℃、0.085 MPa的真空下在旋转蒸发仪上进行回收洗脱剂并进行浓缩，浓缩液然后真空下干燥，得蔓三七叶黄酮产品。实验结果表明，选定306型大孔树脂为蔓三七叶黄酮的吸附树脂，吸附流速2 mL/min；吸附完毕后用70%的乙醇洗脱，洗脱率在90.86%以上，在此条件下得到蔓三七叶黄酮较纯产品，含量为66.6%。

2.6 重结晶次数对产品得率与纯度的影响

重结晶技术对蔓三七叶黄酮产品的得率与纯度变化曲线结果如图3和图4所示。

图3 重结晶次数与产品得率的关系

图4 重结晶次数对产品纯度的关系

由图3可知，蔓三七叶黄酮产品得率随重结晶次数的增加而减少，尤其是第一次结晶得率为89.5%，到第4次时产率降低到55.9%。图4表明，蔓三七叶黄酮纯度随重结晶次数的增加提高较快，提取物纯度由66.6%提高到第4次的91.8%，尤其是经过前3次重结晶后其纯度提高显著。

3 结论

采用大孔吸附树脂-结晶法相结合的集成技术，对蔓三七叶中分离纯化得到含量高的蔓三七叶黄酮。选定306型大孔树脂为蔓三七叶黄酮的吸附树脂，吸附流速2 mL/min；吸附完毕后用70%的乙醇洗脱，洗脱率在90.86%以上，在此条件下得到蔓三七叶黄酮较纯产品，含量为66.6%。上述较纯产品再采用多次重结晶技术对其进一步纯化，蔓三七叶黄酮产品得率随重结晶次数的增加而减少，但其含量随重结晶次数的增加而增加，第4次重结晶后，蔓三七叶黄酮产品含量为91.8%。