补益凉解法对病毒性肝炎小鼠免疫调节影响的实验研究*

熊益群 梁越进 徐文军 刘心亮 穆桂萍 徐绍刚 刘文赫 袁东凯 王静娜

1.广州中医药大学附属深圳市中医院中医药研究所 (广东 深圳, 518033) 2.美国德克萨斯大学医学分校免疫实验室 3.广州中医药大学硕士研究生班

病毒性肝炎是我国临床常见的传染性疾病，与肝硬化和肝细胞癌的发生密切相关，发病机制与病毒感染、免疫调节紊乱有关。而调控免疫，达到控制病情、延缓疾病进展，与抑制肝炎病毒的复制同为目前的重要治疗手段。为此，我们对临床验方补益凉解法方进行了相关实验研究，以探讨其免疫调节作用及其机制。

1 材料与方法

1.1 实验动物、药物和试剂

1.1.1 实验动物 C57BL/6 (B6)小鼠，SPF级，6～8 周龄，雌性，体重20～25g。

1.1.2 主要试剂：IL-33 ELISA试剂盒、sST2-ELISA试剂盒、淋巴细胞分离液、红细胞裂解液、胰蛋白酶、胎牛血清、DMEM培养基、二甲基亚砜、重组IL-33、磷酸盐缓冲液(PBS)等。

1.1.3 主要仪器 CO2培养箱、超净工作台、OLYMPUS倒置显微镜、荧光显微镜、流式细胞仪、自动平衡离心机、化学发光免疫分析仪、荧光定量PCR仪、多功能酶标仪、BI0-PLEX平台等。

1.1.4 药物 补益凉解方：生地、丹皮、山茱萸、女贞子、桑寄生、仙茅、五味子、黄芪、白术、川萆薢、川朴、叶下珠。水煎醇提制成,含生药量2g/ml,冷藏备用(深圳市中医院制剂室制备)。

1.2 实验方法

1.2.1 造模、分组与用药 根据治疗方案将小鼠随机分成6组：空白组、模型组、补益凉解方大、中、小剂量组，以及IL-33组。除空白组外，其余各组小鼠均行腺病毒3×109PFU(AdLacZ)尾静脉注入以建立小鼠急性肝炎模型，空白组小鼠尾静脉注射等容积生理盐水。用药(IL-33和补益凉解方)前，对小鼠血清AdLacZ病毒量、ALT、AST、IL-33、sST2进行检测。

补益凉解法3组小鼠分别给予补益凉解方大、中、小剂量灌胃(分别含生药5.84g/ml、2.92g/ml、1.46g/ml)；IL-33组小鼠按0.8μg/只连续5天腹腔注射鼠重组IL-33；模型组小鼠以等容积PBS液腹腔注射，连续5天。第6天经小鼠眼眶取外周静脉血，处死小鼠采集肝组织标本。

1.2.2 AdLacZ病毒量测定 尾静脉注射腺病毒3×109PFU(AdLacZ)后0、0.5、1、3、6天取3只小鼠取血检测ALT、AST；颈椎脱臼处死动物后，取肝组织用0.5%戊二醛固定30分钟，切片用0.2mg/ml的X-gal在37℃孵育120分钟。感染的细胞因为有β-gal 活性而被染成蓝色，而未感染的细胞用中性红复染。每个肝脏选取8个视野，用显微镜拍照，用Image-Pro Plus 6.0 software分析感染的肝脏细胞占整个肝脏细胞的比例。

1.2.3 肝组织病理学观察 肉眼观察各组大鼠肝脏体积大小、色泽、质地、包膜紧张度等。用10%福尔马林固定肝脏组织，切片，用苏木素伊红染色，普通光学显微镜观察肝组织病理。用Knodell评分系统打分。正常的肝脏没有损伤或细胞浸润，打分0；在门静脉有少数细胞浸润，但并无蔓延至肝小叶区，同时，伴随肝小叶区有凋亡或坏死的细胞为2分； 大量的细胞浸润在门静脉区，扩散的凋亡和坏死为3分。

1.2.4 肝功能指标 谷丙转氨酶(ALT)、谷草转氨酶(AST)。

1.2.5 免疫相关指标 血清及肝组织IL-33、sST2，血清IFN-γ和 IL-2含量。

1.2.6 T淋巴细胞亚群分析 ①分离细胞亚群 肝脏原位灌注、胶原酶消化，30% 和 70% 的Percoll (Sigma) 梯度离心法纯化细胞。脾脏单个核细胞分离自补益凉解方、IL-33处理的小鼠。脾脏淋巴细胞分离：小鼠脱颈椎处死后，脾脏被置入75微米的尼龙膜中挤压，制成单细胞悬液，再加入红细胞裂解液裂解红细胞。对于lineage阴性细胞和阳性细胞的分离。细胞首先用Fc阻断剂(clone 2.4G2, eBioscience) 孵育，然后再加入FITC标记的CD3, CD4, CD8, CD11b, CD11c, B220, NK1.1, Ter-119 和 Gr-1 (eBioscience) 抗体孵育30min。细胞洗涤之后，再用anti-FITC的磁珠孵育，再以LD柱阴选以分离lineage阴性细胞和阳性细胞。

②淋巴细胞培养 分离的细胞种在24孔板，每孔106个细胞，分别加以含有IL-33 10 ng/ml 、补益凉解方不同浓度及IL-2、IL7(10 ng/ml)的培养液，48h后以流式细胞仪检测。Lin-细胞以1×105/ml的密度种在6孔板内，用含IL-2、7和33(10mg/ml)的完全培养基培养。

③流式细胞术 细胞首先用Fc阻断剂孵育，然后再与荧光抗体孵育，接着用荧光二抗孵育。对于胞内染色而言，细胞用PMA (50ng/ml, Sigma)、 ionomycin (750 ng/ml, Sigma) 和GolgiStop (1μl/ml BD Bioscience) 一起孵育4小时。孵育结束后，细胞用eBioscience公司的试剂盒固定破膜，再染色胞内因子。流式细胞术分析培养的肝脏淋巴细胞CD4+、CD8+、CD11b+、 CD11c+、NK及CD4+Foxp3+Treg细胞水平，分析培养后的脾脏淋巴细胞液CD11b、CD11c、NK、CD4+Foxp3+Treg细胞及IFN-γ+CD4+、IFN-γ+CD8+T 细胞。

1.3 统计学方法 采用SAS统计分析软件进行统计学处理。计量资料采用x±s表示，组间比较采用多因素方差分析，P<0.05表示差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 各组小鼠实验期间各项指标变化 见图1。

图1 各组小鼠实验期间各项指标变化图

血清ALT水平在第3天开始，持续上升至第6日(见图1A)，肝IL-33和ST2在同一时间点表现同一模式，截止感染后第6天内，肝内和血清IL-33水平较空白组小鼠显著升高(见图1B，P<0.01，P<0.05)。腺病毒注射引起显著的肝门及小叶区淋巴细胞渗透，桥接坏死伴随嗜酸性小体在三个相邻的区域被发现(见插页彩图1C，箭头所示)。补益凉解法小剂量组和模型组在肝组织学分数方面不具可比性(P>0.05)(见图1D)，补益凉解法小剂量组嗜酸性小体数目显著降低(P<0.05)(见图1E)，同时显著降低实验动物血清ALT水平(P<0.01)(见图1F),与IL-33组相比，作用相似(P>0.05)。

2.2 各组小鼠实验期间T淋巴细胞亚群变化情况 见图2。图2A所示，注射AD病毒各组小鼠第6天，可见肝内淋巴细胞聚集程度是空白组的8倍之多，而且1/2的肝内淋巴细胞(IHL)是CD8+T细胞。 IHL的数目并未被补益凉解法治疗所改变，这与肝组织学分数是相同的。补益凉解法组和模型组小鼠肝内浸润的CD4+和CD8+T细胞群中被激活的T细胞亚群(CD44hiCD62Llo)并不具备可比性(P>0.05)(见图2B)，这表明补益凉解法并不影响炎症肝脏内效应T细胞的迁移，但能显著减少CD11b+, CD11c+和NK细胞的数量(分别为P<0.05，P<0.01，P<0.01), 同时增加了Treg细胞的数量(P<0.05)(见图2C)。NK细胞和Treg细胞的这种减少或增加的情况同样发生在脾脏(分别为P<0.01，P<0.01)(见图2D)。 补益凉解法降低CD11b+和CD11c+细胞上MHCII的表达和CD11b+、CD11c+细胞CD80的表达。根据两组小鼠肝内β-gal活性程度，推测补益凉解法组AD肝内病毒清除率情况(见插页图2E)，实验结果显示补益凉解法组和模型组感染后6天感染率分别为(10.6% ± 0.8%)和(7.3% ± 0.7%)，感染后14天感染率分别为(0.8% ± 0.2%)和(0.7% ± 0.3%)，AD病毒在感染后21天基本完全消失(每一组均<0.1%)。PCR方法测定肝组织内病毒载量结果与β-gal方法的结果一致，两组小鼠的肝内病毒基因表达稳定下降。但补益凉解法与PBS肝内病毒清除率并无明显差别(P>0.05)(插页图2E)。

图2 各组小鼠实验期间T淋巴细胞亚群变化图

2.3 各组小鼠实验期间细胞毒性T淋巴细胞(CTL)变化 为了更进一步研究补益凉解法中药在减轻肝损伤中的机制，我们对补益凉解法处理后小鼠炎症细胞分泌的细胞因子进行了检测。肝内IFN-γ+CD4+和IFN-γ+CD8+T细胞百分比，补益凉解法组相对模型组显著增加(见插页图3A)。补益凉解法组小鼠血清IFN-γ和IL-2水平上调(分别为P<0.01，<0.05)(见图3B)，IFN-γ、颗粒酶B和穿孔素在两组间差异均有显著性意义(分别为P<0.05，P<0.05，P<0.05)(见图3C)，表示补益凉解法能够增强病毒性肝炎小鼠1型免疫应答。

图3 各组小鼠实验期间CTL变化图

3 讨论

实验结果显示，补益凉解法驱动了肝内和血清1型(IL-2和IFN-γ)免疫应答，原有的细胞因子和趋化因子微环境聚集了大量高活性CD8+和CD4+T细胞至肝内。但是，IL-33/ST2相互作用引起的这种激进的免疫行为并没有进一步加重肝损伤，从镜下肝组织嗜酸性小体的明显减少和血清ALT水平明显下降来看，它限制了肝损伤的进一步发展。因此，它可能通过某些直接或间接的调节机制，调节着肝脏潜在的保护效应。

IL-33[1～2]是炎症反应和免疫偏倚的重要调节因子，既可以作为转录因子发挥作用，又可以分泌至胞外结合受体，作为细胞因子发挥作用。在不同疾病中，IL-33发挥着不同生物学调节作用，对正常细胞的存活增殖及多种疾病的发病发展都具有重要作用。

研究结果显示，模型组小鼠IL-33/ST2及ALT、AST均有升高，补益凉解法组(小剂量占优)小鼠肝功能复常，IL-33/ST2也随之下降，表明IL-33/ST2的升高确与肝脏炎症有关。

补益凉解法组方原则为凉血滋肾益气，兼清热解毒化湿。方中山茱萸、桑寄生、仙茅、女贞子、五味子滋肾，地黄、牡丹皮凉血散血；黄芪、白术健脾益气；川萆薢、川朴理气化湿；叶下珠清热解毒。全方配伍，合清、透、活、补为一体，补中有清，清中有透。现代药理学研究证实，方中的大多数中药被证实具有调节免疫和抗病毒的作用。

研究表明山茱萸多糖可明显提高小鼠腹腔巨噬细胞吞噬百分率和吞噬指数;可显著促进小鼠溶血素的形成,并显著促进小鼠淋巴细胞的转化[3]。山萸与清热利湿解毒类中药配伍，可抑制亢进的体液免疫反应。五味子具有护肝降酶，抗菌，提高免疫功能，增强免疫力的作用[4]。黄芪[5]能增强机体免疫力，促进新陈代谢，抑制病毒，杀菌，调节血糖，改善心功能，有保护肝脏，降低血压等作用[5]；白术能促进细胞免疫，抗菌，保护肝脏的作用[6]。生地中其地黄多糖均可使小鼠的脾指数显著提高，单核巨噬细胞的吞噬功能增强，还可明显促进T 淋巴细胞增殖，使腹腔巨噬细胞的吞噬活性增强[7]。丹皮酚使小鼠脾脏指数和胸腺指数明显提高，增强淋巴细胞转化率，对特异性细胞免疫功能有明显的作用，增强机体细胞免疫功能[8]。叶下珠有效成分鞣质对 HBeAg具有明显的抑制作用，多糖类是一种绿色免疫调节剂，它能激活体内免疫细胞，增强机体正气[9]。其复方制剂及叶下珠提取物均有很好的护肝降酶作用，AST和 ALT明显下降，肝脾肿大情况明显缓解。萆薢对小鼠单核巨噬系统的功能有明显的促进作用。

补益凉解法防护病毒性肝损伤的作用机制可能是通过免疫调节，增强了Th1类细胞因子的表达，下调IL-33/ST2的表达，从而降低肝脏损伤。而补益凉解法对病毒的影响，尽管其清除率较对照组高，但统计学意义不大。