大鼠颈脊髓半侧挫伤模型的建立及其组织学变化的研究

刘恩志 严 瀚 董婉华 芦 虎 陈 斌 梁英杰 郭东明

(广州市第一人民医院脊柱外科，广东 广州 510180)

脊髓损伤可能会导致患者出现上肢神经功能的永久性损伤，严重影响其生活质量[1]，流行病学调查显示，大约40%的脊髓损伤是发生在颈脊髓段[2]。高危颈椎在临床上主要表现为部分患者影像学上存在颈椎椎管狭窄引起脊髓严重受压却无或仅有轻微临床症状，但受到轻微外伤即可能出院严重的瘫痪，被认为是颈脊髓受严重压迫后的一种亚临床的临界代偿状态。临床上，高危颈椎的患者仅受到低能量损伤时即造成严重的颈脊髓损伤，引起严重残疾，对患者家属和社会带来极大心理和经济负担。本研究通过构建大鼠颈脊髓损伤模型，观察其在不同程度脊髓损伤中的组织学变化，为临床研究高危颈椎提供基础。

1 材料与方法

1.1 实验动物及分组

实验用动物均严格遵循《实验动物质量管理方法》和《中华人民共和国实验动物管理条例》法规并得到当地动物伦理委员会的同意。将80只成年雄性SD大鼠(约260～300 g)，8周龄，遵照随机原则分成A(n=30)、B(n=30)和C(n=20)共3组，其中A和B组为实验组，分别接受1.2 mm及2 mm深度C5脊髓半挫伤手术，C组为假手术组，接受半侧椎板切除手术。术后对所有大鼠进行行为学评价，8周后处死，取材，分析大鼠组织学变化。

1.2 制备半侧颈C5脊髓挫伤模型鼠

用10%的水合氯醛按照0.3 ml/100 g的剂量将大鼠麻醉，然后在其C5节段做半侧椎板切除手术从而让脊髓暴露出来，再用特制的椎夹固定C4～6节段，连接脑立体定位仪。按照李榕等[3]的方法制备大鼠不同程度脊髓损伤模型。模型制备成功后，各组均肌肉注射青霉素，防止术后感染，再将大鼠单笼饲养，维持温度在37 ℃左右。脊髓损伤后应观察到大鼠前爪闭合，同侧前肢瘫痪。

1.3 行为学评分指标

在术后1、7、14、28、42及56 d按照Cao Y等[4]的方法对大鼠前肢进行运动功能评分，该评分方法是以BBB 评分为基础进行修正，最低分为0，最高分17。具体方法为：将大鼠放在直径100 cm， 高40 cm左右的旷场中自由活动，由高清数码相机记录大鼠活动。采用单盲法，两名人员分别单独评分，最后采用两者评分的平均值作最终评分。

1.4 组织学分析

术后6周用10%的水合氯醛按照0.3 ml/100 g的剂量将大鼠麻醉，取材，依照李榕等[3]的方法切片染色，观察病理组织学变化，用Image proplus 5.0计算脊髓损伤面积及灰质和白质残存面积。

1.5 统计学分析

2 结 果

2.1 半侧颈C5脊髓挫伤模型鼠的力学参数

一般认为最大位移点和脊髓接触点二者的差值是挫伤位移，根据载荷和位移的线性关系，得到挫伤过程中的挫伤位移以及相应的打击速度和在挫伤过程中产生的最大打击力与能量。设置中度组和重度组的打击速度均为500 mm/s，中度组打击后的挫伤位移1.2 mm，重度组打击后的挫伤位移2 mm。比较两组在挫伤过程中产生的最大打击力与能量发现，中度组均低于重度组，差异具有统计学意义(P<0.05)。如表1。

2.2 三组大鼠前肢运动功能的评分比较

建模后大鼠均出现了显著的脊髓对应侧前肢功能运动性缺陷，主要症状为前肢不同程度的瘫痪，前爪出现闭合屈曲功能障碍，而对侧前肢功能未见异常。假手术组术后8周每个时间点的行为学评分均接近满分17 分，未见前肢出现运动功能障碍。建模成功后1 d，挫伤深度1.2 mm组即中度损伤组模型鼠仅有一个关节的运动或者伴有合并其他前肢关节的小幅度运动。在建模后1～4 周时，中度损伤组大鼠前肢功能基本恢复，可见大鼠持续性足掌触地行走，第28天的评分为(10.45±1.28)，与损伤后1 d比较差异有统计学意义(P<0.001)。术后4周大鼠前肢功能得到恢复，第8周时表现为持续足掌行走，爪在行走的过程中均与身体保持平行状态。而重度损伤组需要较长时间获得前肢功能恢复。第42 d时可见重度损伤组大鼠足背触地行走，评分为(8.07±0.86)。而在术后8周时前肢功能只有部分恢复，行为学表现为基本足背触地行走，间断性足掌触地行走，评分为(8.89±1.05)，相比中度损伤组行为学评分较低，二者相比差异有统计学意义(P<0.001)。如表2。

表1 大鼠半侧颈脊髓挫伤打击参数

2.3 组织学结果

术后8周，假手术组脊髓未见损伤，灰、白质结构无病理性改变；中度和重度损伤组脊髓灰、白质结构出现病理性改变，两组大鼠脊髓损伤面积以及灰、白质残存面积差异有统计学意义，见表3。

表2 三组大鼠前肢运动功能评分

注：#表示与中度组损伤后1 d比较，P<0.001；##表示与中度组损伤后56 d比较，P<0.001。

表3 大鼠脊髓损伤处灰、白质残余面积比较

3 讨 论

临床上脊髓损伤(spinal cord injury，SCI)是一种常见的、致残率较高的创伤性疾病，通常患者自身无法恢复治愈，且发病率逐年上升。高速打击造成大鼠的脊髓挫伤是当前与临床上脊髓损伤相关性最好、最容易获得的一种研究模型，也是脊柱外科和神经科学领域常用的研究模型。临床上开展脊髓损伤的研究无法依靠系统的研究，因此建立理想的实验动物模型是脊髓损伤研究的首要条件。目前脊髓损伤研究领域的挫伤型脊髓损伤模型鼠，在一定程度上和人类脊髓损伤的病理和生理特点具有很大的相似性,可以忽略持续性的挤压作用产生的影响；有别于挫伤型脊髓损伤，压迫型脊髓损伤模型是非瞬间损伤, 有利于神经功能和代谢改变的研究；而锐性脊髓损伤模型更适于再生性实验研究, 但与临床的相关性较差；除此之外，脊髓缺血及再灌注损伤模型与高速产生的脊髓损伤存在很大的差异，因此不能作为脊髓损伤的临床研究模型[5]。

本研究通过挫伤大鼠半侧脊髓建立颈脊髓损伤模型，较正中挫伤损伤轻，且在一定程度上有利于模型鼠损伤后的恢复和后续的实验观察研究。通过效仿Sparrey等[6]建立灵长类脊髓损伤模型的方法，本研究模型鼠的颈脊髓挫伤位置在C5节段左侧，以此避免脊髓在高速挫伤过程中发生移位[7]，确保成功构建模型。研究[8]表明在建立其他动物颈脊髓挫伤模型中，构建的动物模型之间的重复性较差，反映在位移、速度和打击最大力等参数上，不同实验组间存在较大的差异 。因此，本实验的关键之处在于对损伤节段颈椎的固定，以此实验过程中不同大鼠之间脊髓挫伤有可重复性。

本研究通过前肢运动功能评价分析不同程度脊髓损伤和大鼠神经功能障碍之间存在的关系，通过分析发现脊髓继发性损伤对功能产生一定的影响，表现在组间大鼠伤侧前肢运动功能在术后都明显下降，从第2周开始，中度组较重度组伤侧前肢使用率较高，而重度组在短时间内前肢功能障碍改善不明显。实验结果显示2～4 周是一个较快的恢复期，4周之后实验组基本达到平台期，在实验终点重度挫伤组大鼠仍然表现出一定程度的前肢功能运动性障碍，与先前关于颈椎骨折错位模型有类似的结果[9]。尽管如此，重度和中度挫伤组大鼠脊髓功能恢复到达平台期所需时间并没有显著性差异，推测可能是该时期胶质瘢痕形成的缘故，对神经纤维的再生和轴突再髓鞘化产生了抑制作用[10]，同时组织学结果也在一定程度上解释了行为学上出现的神经功能障碍等症状。颈脊髓半侧挫伤的位移和速度决定了白质和血脊髓屏障被破坏的程度和范围，也会影响脱髓鞘区域的范围[11]。本研究行为学结果显示，颈脊髓挫伤的深度与灰白质损害存在一定的相关性，同时脊髓腹侧组织的破坏也更加明显。以往的学者也发现胸髓损伤中，下肢的运动功能更依赖于脊髓白质结构的完整性[12-13]，本实验颈脊髓损伤模型鼠的各项运动功能的评分与残存的白质和灰质组间差异具有统计学意义(P<0.05)，因此可以初步推断大鼠颈髓损伤后神经运动功能障碍与灰白质的完整性存在一定的关系[14-15]。脊髓损伤后的病理生理机制非常复杂，研究脊髓损伤的组织病理学、细胞和组织化学以及电生理变化，对于阐明脊髓损伤的自然病程和探索新的治疗方法有极为重要的指导意义。