脑脊液T-SPOT检测在结核性脑膜炎诊断中的临床应用价值

宋月娟，冯强生，哈小琴

(中国人民解放军兰州军区兰州总医院检验科，兰州 730050)

结核性脑膜炎(tuberculous meningitis，TBM)的早期表现不典型，治疗周期长，尽管积极抗结核治疗，但病死率仍高达19.0%～28.9%[1]，早期准确的诊断是治疗的关键。目前尚缺乏理想的早期诊断结核性脑膜炎的实验方法，脑脊液(cerebrospinal fluid，CSF)涂片抗酸染色敏感度往往<20%，脑脊液培养敏感度为25%～70%，在发展中国家仅为10%，且需要等待数周才能得到结果[2]。而采用PCR法检测脑脊液中结核分枝杆菌DNA，由于其假阳性较多，实验条件要求较高，故难以在结核性脑膜炎多发的欠发达地区普及和推广。结核斑点试验(T-SPOT)广泛用于结核病的诊断，但T-SPOT脑脊液检测在结核性脑膜炎中的诊断价值鲜见文献报道。本文回顾性分析我院82例结核性脑膜炎脑脊液T-SPOT检测的患者资料，分析脑脊液标本结核斑点试验(T-SPOT)检测、CSF生化和血清降钙素原(PCT)的变化，为结核性脑膜炎患者的早期诊断提供实验依据。

1 材料与方法

1.1 研究对象 对本院221份脑脊液标本进行筛查，统计脑脊液淋巴细胞计数大于100×106/L或者高度怀疑脑膜炎患者淋巴细胞计数大于50×106/L的82例脑脊液标本进行结核斑点试验检测的实验结果，查阅临床病例资料，根据患者临床诊断，统计结核性脑膜炎实验组和对照组患者脑脊液蛋白、脑脊液葡萄糖、脑脊液氯离子、脑脊液淋巴细胞计数和患者血清PCT等指标进行ROC曲线分析。

1.2 仪器与试剂 T-SPOT TB试剂盒购自英国Oxford公司。离心机购自湖南湘仪离心机仪器有限公司。

1.3 检测方法

1.3.1 脑脊液结核斑点试验操作步骤：取脑脊液4 ml以上，放入15 ml离心管中(加AIM-V至3 ml)，700 g离心7 min；倒掉上清，混匀细胞沉淀后再加入AIM-V培养液至3 ml，700 g离心7 min；倒掉上清，加入500 μl AIM-V培养液，震荡混匀；取80 μl细胞悬液至细胞计数仪或显微镜计数细胞，按顺序加入阴性对照(AIM-V)、抗原A，抗原B，阳性对照，各50 μl，每孔加100 μl配置好的细胞液(2.5×105/孔)；标注时间，放入CO2培养箱培养16～20 h，次日准备PBS液，根据标本量计算酶标二抗所需的量，以1∶200的比例将酶标二抗原液与PBS液混合(混合一定要充分均匀)，制成二抗工作液；将过夜培养的96孔板中培养液倒掉，每孔加入200 μl PBS液洗板4遍后拍干板孔，每孔加50 μl二抗工作液4～8℃孵育1 h；将酶标二抗液体倒掉，每孔用PBS液洗涤4遍，拍干后加显色液各50 μl，避光静置5～10min(阳性孔出现密布的斑点)，用蒸馏水洗涤终止反应；将板孔内液体拍干，晾至底膜干透可以4×物镜显微镜检斑点数或上机读取并记录报告结果。

1.3.2 检测原理：脑脊液分离单个核细胞；结核特异性抗原(ESAT-6/CFP10)与脑脊液单个核细胞孵育，结核致敏的效应T淋巴细胞分泌γ-干扰素“双抗夹心法”检测释放的γ-干扰素，从而检测结核致敏的效应T淋巴细胞是否存在，从而判断患者是否存在结核分枝杆菌感染(包括潜伏性结核分枝杆菌感染与活动性结核分枝杆菌感染)。

1.4 统计学分析 软件应用spass17.0，非计量数据用卡方检验，多组数据比较采用ROC曲线。

2 结果

2.1 82例脑脊液标本结核斑点试验检测结果 脑脊液T-SPOT试验检测在结核性脑膜炎患者中的阳性率为64.63%(53/82)，敏感度为98.11%，特异度为100%，其中结核性脑膜炎患者年龄中位数为30.08岁，男/女为2.71。非结核性脑膜炎29例患者中，病毒性脑膜炎8例，细菌性脑膜炎5例，疑似结核性脑膜炎3例，炎性脱髓鞘性疾病1例，非脑炎11例，假阳性1例。

2.2 结核性脑膜炎患者和非结核性脑膜炎患者脑脊液生化和血清感染指标ROC曲线分析 ROC曲线下面积(AUC)大小分别为脑脊液淋巴细胞计数0.996，脑脊液蛋白0.965，PCT 0.392，脑脊液葡萄糖0.109和脑脊液氯离子0.061，所以脑脊液淋巴细胞计数和脑脊液蛋白具有较高的敏感度和特异度，且结核性脑膜炎患者脑脊液淋巴细胞计数和脑脊液蛋白的均值分别为323.88±198.76个/L，1 478.2±778.64 mg/L。

图1 结核性脑膜炎患者和非结核性脑膜炎患者脑脊液生化和血清PCT ROC曲线分析

3 讨论

结核斑点实验(T-SPOT)作为一种新的酶联免疫斑点技术，为结核病的早期诊断提供了新的方法。它是利用结核分枝杆菌感染患者淋巴细胞中存在结核特异的活化T淋巴细胞，这些淋巴细胞在受到结核分枝杆菌特异抗原ESAT- 6或CFP-10刺激，分泌γ干扰素，γ干扰素是结核分枝杆菌感染后机体免疫应答中最重要的细胞因子，具有抗感染、抗肿瘤活性和免疫调节作用，在机体抗感染与免疫中发挥重要作用[3，4]。据国外文献报道，结核斑点试验诊断结核性脑膜炎的敏感度为83%～97%，特异度高达100%[5]。回顾性分析我院82例疑似结核性脑膜炎患者脑脊液T-SPOT检测结果、脑脊液生化指标和血清感染指标PCT的变化，表明T-SPOT检测在结核性脑膜炎患者具有较高的阳性率为64.63%(53/82)，敏感度为98.11%，特异度为100%，敏感度和特异度均高于陈永芳等[6]研究的外周血T-SPOT.TB检测结核性脑膜炎敏感度67.5%和张秀英等[7]

T-SPOT.TB法检测脑脊液单个核细胞对结核性脑膜炎检测敏感度93.33%，特异度96.67%。结核性脑膜炎患者和非结核性脑膜炎患者脑脊液生化和血清感染指标PCT ROC曲线分析曲线下面积(AUC)大小分别为脑脊液白细胞数0.996，脑脊液蛋白0.965，PCT 0.392，脑脊液葡萄糖0.109和脑脊液氯离子0.061，表明脑脊液淋巴细胞计数和脑脊液蛋白测定价值优于血清PCT，脑脊液葡萄糖和脑脊液氯离子的测定。数据显示结核性脑膜炎患者脑脊液淋巴细胞计数和脑脊液蛋白的均值分别为323.88±198.76个/L，1 478.2±778.64 mg/L。但脑脊液蛋白含量受年龄的影响以及淋巴细胞计数受创伤和蛛网膜下腔出血等因素影响[8]，应注意排除其他因素的干扰。

本实验检测方法检验时间短，24 h内可以回报临床实验结果，而且标本阴阳性结果观测直观，易于保存，并且阳性率、敏感度和特异度高，对实验条件要求较低，与临床同类实验XpertMTB/RIF对结核性脑膜炎的临床诊断价值比较有待近一步的验证[9]。本实验缺点为患者脑脊液标本要求大于5 ml，需进行脑脊液淋巴细胞数计数筛查合格标本，而且标本放置时间不宜过长，需要及时处理。

总之，脑脊液T-SPOT.TB检测是诊断结核性脑膜炎的一种较为快速、经济、敏感度和特异度高的一种方法，可用于结核性脑膜炎的早期快速诊断。