柴芪汤对代谢综合征模型大鼠血清ICAM-1和VCAM-1的影响△

王红梅，葛秉宜，王颖，刘晶，朱梦云，张立平

（1.北京中医药大学东方医院，北京 100078；2.北京市怀柔区中医医院，北京 101400；3.北京中医药大学研究生院，北京 100029）

代谢综合征（metabolic syndrome，MetS）包括腹型肥胖、胰岛素抵抗或糖耐量异常、高血压、血脂异常4个疾病组分[1]，越来越多的研究认为MetS关键发病因素为胰岛素抵抗，其最终可导致心肌梗死、中风等心脑血管恶性事件的发生，故MetS又被称为胰岛素抵抗综合征和代谢性心脑血管综合征[2]。一些研究[3-7]认为MetS的慢性炎症状态是MetS最终发展为动脉粥样硬化的病理基础，其中细胞间黏附分子1（ICAM-1）和血管细胞黏附分子1（VCAM-1）在动脉粥样硬化形成过程中起着重要的作用[8]，MetS病人的ICAM-1和VCAM-1水平明显增高[9]，因此黏附因子也成为评价MetS疗效的有用工具[10]。

本课题组既往工作证实具有健脾疏肝、活血化瘀功效的柴芪汤（由黄芪、柴胡、白术、枳实及三七粉组成）干预MetS有效，对相关炎性因子具有调节作用[11-15]。本研究使用喂养型MetS大鼠模型观察柴芪汤对ICAM-1和VCAM-1的动态影响，进一步研究柴芪汤防治MetS疗效及可能的抗炎作用机制。

1 材料

1.1 实验动物

清洁级雄性SD大鼠60只，8周龄，体质量（280±10）g，购自北京维通利华实验动物技术有限公司 [实验动物许可证号：SCXK（京2012-0001）]。

1.2 药物和试剂

自拟方柴芪汤由黄芪30g、柴胡10 g、白术10 g、枳实10 g及三七粉3 g 5味中药组成，上述饮片购自北京中医药大学东方医院中药房，并由该院煎药室代煎制备，煎制过程严格遵照国家中医药管理局制定的 《医疗机构中药煎药室管理规范》（国中医药发 〔2009〕3号）执行。

普通清洁级动物饲料及高脂高糖高盐配制饲料（含大鼠基础饲料52.5%、其余由熟猪油10%、蛋黄粉10%、胆固醇2%、奶粉10%、果糖10%、食用盐5%、胆盐0.5%组成）均由北京科澳协力饲料有限公司提供。

生化试剂盒购自中生北控生物科技股份有限公司，放射免疫分析试剂盒购自北京福瑞润康生物技术有限公司，酶联免疫分析（ELISA）试剂盒购自上海联硕生物科技有限公司。

2 方法

2.1 分组

60只雄性SD大鼠随机分为3组，染发剂标号，分别为正常组18只，模型组24只，中药预防组18只。在第8周末取材后，从模型组中随机抽取6只作为中药治疗组，此时共4组大鼠，每组6只（笔者前期实验研究[11-15]已经比较了柴芪汤与罗格列酮组对MetS的疗效。而本研究重点探讨柴芪汤预防性给药和治疗性给药的疗效差异，故未设阳性对照药组）。以上大鼠采取分笼饲养，每笼6只，动物室室内温度19～24℃，相对湿度60%～70%，自由饮水，明暗周期12 h／12 h，各组大鼠分笼适应性喂养7 d后开始模型制备。

2.2 造模

正常组：仅给基础饲料12周。模型组：给予高脂高糖高盐饲料12周。中药预防组：自造模第1周开始给予高脂高糖高盐饲料12周，从第1周给予柴芪汤 5.71 g·kg－1·d－1灌胃（本研究重点不是探讨柴芪汤的量效关系，而且本课题组前期研究[11]已经就柴芪汤高中低剂量对MetS的治疗效果进行了探讨。本研究依照 “人和动物间按体表面积折算的等效剂量比值”计算柴芪汤的等效剂量，该计算方法为大家公认，且与本课题组上述研究结果一致）。中药治疗组：自造模第1周开始给予高脂高糖高盐饲料12周，从第 9周给予柴芪汤 5.71 g·kg－1·d－1灌胃。每天给予正常组和模型组等同中药组所灌服中药体积的0.9%氯化钠溶液灌胃。

2.3 取材

于第4、8、12周的周末进行取材，每组随机抽取6只。

大鼠血清的获取：取血前禁食12 h，10%水合氯醛腹腔注射麻醉（3.7 mL·kg－1），真空采血管腹主动脉取血，静置0.5 h后置于离心机中以4℃、3000 r·min－1离心15 min，移液枪吸取血清，放置－80℃冰箱冻存备用。

2.4 指标测定

全自动生化分析仪检测血清三酰甘油（TG）、总胆固醇（TC）、高密度脂蛋白（HDL）、低密度脂蛋白（LDL）、空腹血糖（FBG）。放免法检测空腹胰岛素（FINS）。ELISA法测定血清 ICAM-1、VCAM-1。上述具体操作按照试剂盒说明书。根据FBG和FINS，按照HOMA稳态模型，计算出胰岛素抵抗指数（IRI）＝（FBG×FINS／22.5），评价胰岛素抵抗情况。

2.5 统计方法

3 结果

3.1 各组大鼠血清FGB、FINS、IRI和血脂比较

第8周模型组与正常组相比，模型组FBG增高，差异有统计学意义（P＜0.05）；FINS值增高，但无统计学差异（P＞0.05）；IRI值较低，差异有统计学意义（P＜0.01）。

第12周中药治疗组与模型组相比，治疗组FBG、FINS、IRI均降低，差异有统计学意义（P＜0.01）。中药预防组与模型组相比，预防组 FBG、FINS、IRI均降低，差异有统计学意义（P＜0.01）。中药预防组与治疗组相比，预防组FBG和FINS均较低，但无统计学差异（P＞0.05），预防组IRI值较治疗组低，且差异有统计学意义（P＜0.05）。结果见表1。

第8周模型组与正常组相比，模型组TC及LDL升高，差异有统计学意义（P＜0.01）；模型组TG较高，差异有统计学意义（P＜0.05）；模型组HDL较正常组略低，但两组间差异不具有统计学意义（P＞0.05）。

第12周中药治疗组与模型组相比，治疗组TC、TG、LDL均降低，差异有统计学意义（P＜0.01），而两组间HDL无统计学差异（P＞0.05）。中药预防组与模型组相比，预防组TC、TG、LDL均降低，差异有统计学意义（P＜0.01），而两组间HDL无统计学差异（P＞0.05）。中药预防组与治疗组相比，预防组TC较低，有统计学差异（P＜0.05）；LDL也降低，有统计学差异（P＜0.01）；而两组间TG及HDL无统计学差异（P＞0.05）。结果见表2。

表1 柴芪汤各组大鼠血清FGB、FINS和IRI变化（±s，n＝6）

表1 柴芪汤各组大鼠血清FGB、FINS和IRI变化（±s，n＝6）

注：与正常组比较，*P＜0.05，**P＜0.01；与模型组比较，△P＜0.05，△△P＜0.01；与中药预防组比较，＃P＜0.05，＃＃P＜0.01；下同。

IRI第8周 第12周 第8周 第12周 第8周 第12周正常组 7.12±1.39 8.26±0.67 6.57±1.38 6.60±0.71 2.04±0.44 2.41±0.24模型组 9.47±2.25* 10.55±1.55** 7.64±1.39 8.37±1.24* 3.14±0.48** 3.93±0.81**中药预防组 6.88±1.31△ 4.77±0.63**△△ 7.75±0.92 4.89±1.10*△△ 2.39±0.58△ 1.04±0.27**△△中药治疗组 6.11±0.69**△△＃ 6.15±1.37△△ 1.67±0.42*△△＃FBG／mmol·L－1 FINS／mIU·L－1组别

表2 柴芪汤各组大鼠TC、TG、HDL、LDL变化±s，n＝6）mmol·L－1

表2 柴芪汤各组大鼠TC、TG、HDL、LDL变化±s，n＝6）mmol·L－1

TC TG HDL LDL第8周 第12周 第8周 第12周 第8周 第12周 第8周 第12周正常组 1.56±0.28 1.91±0.25 0.24±0.07 0.34±0.07 1.13±0.22 1.11±0.29 0.22±0.04 0.42±0.05模型组 2.30±0.30**2.37±0.22** 0.32±0.07* 0.45±0.08* 1.02±0.19 1.08±0.11 0.55±0.20**0.53±0.06**中药预防组 1.82±0.35△ 1.25±0.15**△△ 0.20±0.05△△ 0.20±0.02**△△ 0.92±0.22 1.25±0.26 0.39±0.10*△ 0.24±0.04**△△中药治疗组 1.55±0.23*△△＃ 0.27±0.07△△ 1.13±0.11 0.33±0.07*△△＃＃

3.2 各组大鼠血清ICAM-1浓度比较

第4周的模型组ICAM-1浓度较正常组升高，差异具有统计学意义（P＜0.01）；中药预防组相比正常组升高，差异具有统计学意义（P＜0.01）；中药预防组与模型组之间的差异不具有统计学意义（P＞0.05）。

第8周的模型组ICAM-1浓度相比正常组升高，差异具有统计学意义（P＜0.01）；中药预防组相比正常组升高，差异具有统计学意义（P＜0.05）；中药预防组的ICAM-1浓度低于模型组，差异具有统计学意义（P＜0.05）。

第12周的模型组ICAM-1浓度相比正常组升高，差异具有统计学意义（P＜0.01）；中药治疗组和中药预防组较正常组均升高，差异具有统计学意义（P＜0.05）；中药治疗组低于模型组，但差异不具有统计学意义（P＞0.05）；中药预防组低于模型组，差异具有统计学意义（P＜0.01）；中药预防组低于治疗组，两者间差异具有统计学意义（P＜0.05）。结果见表3。

3.3 各组大鼠血清VCAM-1浓度比较

第4周的模型组VCAM-1浓度较正常组升高，差异具有统计学意义（P＜0.01）；中药预防组相比正常组升高，但差异不具有统计学意义（P＞0.05）；中药预防组低于模型组，差异不具有统计学意义（P＞0.05）。

第8周的模型组VCAM-1浓度相比正常组升高，差异具有统计学意义（P＜0.01）；中药预防组相比正常组升高，差异不具统计学意义（P＞0.05）；中药预防组低于模型组，差异不具有统计学意义（P＞0.05）。

第12周的模型组VCAM-1浓度相比正常组升高，差异具有统计学意义（P＜0.01）；中药治疗组较正常组升高，差异具有统计学意义（P＜0.01）；中药预防组较正常组升高，差异不具有统计学意义（P＞0.05）；中药治疗组低于模型组，但差异不具有统计学意义（P＞0.05）；中药预防组低于模型组，差异具有统计学意义（P＜0.01）；中药预防组相比治疗组降低，差异具有统计学意义（P＜0.05）。结果见表4。

4 讨论

目前MetS动物模型大多采用诱发性模型。根据诱发物质的不同分为食物诱发性模型、化学物质诱发性模型、喂养＋化学物质诱发性模型和外科手术干预模型等。相比其他几种造模方法，食物诱发性模型的好处在于可模拟环境因素如限制其活动等，成模率较高，模型接近临床，但造模时间较长，模型相对不稳定。本研究采用高脂高糖高盐饮食8周诱导造模方法已经被我们课题组之前的研究[11-15]多次使用并验证。造模和成模情况与其他课题组研究结果[16-18]一致。本实验中大鼠经高脂高糖高盐饲料喂养8周后，与正常组大鼠相比较，模型组大鼠IRI升高（P＜0.01），血脂 TC（P＜0.01）、TG（P＜0.05）、LDL（P＜0.01）升高，出现典型MetS组分，提示造模成功。第12周的中药治疗组、预防组与模型组相比，IRI、TC、TG、LDL均较模型组降低（P＜0.01）。中药预防组与治疗组相比，IRI、TC值均比治疗组低（P＜0.05），LDL也降低（P＜0.01）；再次证实了柴芪汤对于MetS糖脂代谢和胰岛素抵抗的调节作用。

表3 柴芪汤各组大鼠血清ICAM-1浓度（±s，n＝6）ng·L－1

表3 柴芪汤各组大鼠血清ICAM-1浓度（±s，n＝6）ng·L－1

时间 正常组 模型组 中药预防组 中药治疗组第4周 42.29±3.75 57.76±5.31** 53.72±4.16**第8周 41.53±4.14 64.06±9.14** 52.67±11.81*△第12周 42.93±2.26 69.33±11.45** 54.47±9.18*△△ 65.63±6.48*＃

表4 柴芪汤各组大鼠血清VCAM-1浓度（±s，n＝6）μg·L－1

表4 柴芪汤各组大鼠血清VCAM-1浓度（±s，n＝6）μg·L－1

时间 正常组 模型组 中药预防组 中药治疗组第4周 472.81±70.2 648.02±110.90** 563.22±61.01第8周 532.25±60.11 701.00±111.93** 620.47±123.67第12周 541.44±87.43 710.98±82.00** 575.87±29.32△△ 679.88±57.41**＃

ICAM-1和VCAM-1同属免疫球蛋白家族。生理情况下ICAM-1不表达或呈低表达或状态，当有炎症反应发生，ICAM-1可在外界刺激下表达增强。VCAM-1出现晚于前者，可表达于经外界刺激而活化的内皮细胞表面，两种黏附分子均参与炎症反应。而血清ICAM-1和VCAM-1的浓度水平可以反应动脉内皮 ICAM-1和 VCAM-1的表达水平[19-20]。Davies等[21]研究表明，在动脉粥样硬化发生过程的不同时期，内皮黏附分子的表达量也不同，其中ICAM-1、VCAM-1在脂纹期主要表达于动脉内皮细胞表面，可促进单核细胞向内皮细胞黏附，进入炎症部位；而随着病变的进展，黏附分子在内皮的表达逐渐减弱，而在纤维斑块中其表达增强，提示 ICAM-1、VCAM-1是动脉粥样硬化早期的病理变化及斑块进展的潜在机制，并与硬化严重程度有关。多个研究[22-25]亦证实MetS患者的可溶性ICAM-1和VCAM-1水平明显增高，其与MetS患者的动脉内皮损失、动脉粥样硬化密切相关。本研究中模型组血清ICAM-1和VCAM-1比正常组的高，差异具有统计学意义，进一步证实了MetS的炎性机制。

关于柴芪汤对黏附分子的影响作用，实验结果发现：4周末的模型组大鼠 ICAM-1已经开始升高，而中药预防组的升高程度相比模型组较低，但差异不具统计学意义，而8周末及12周末的中药预防组ICAM-1浓度的升高低于模型组，差异均具有统计学意义，说明柴芪汤对炎症因子具有抑制作用，但中药预防组的浓度相比正常组升高，而且差异具有统计学意义，说明单纯的中药预防可能无法完全祛除病因（高脂高盐高糖饮食）；于第9周开始进行中药治疗的中药治疗组大鼠在第12周末的ICAM-1浓度的升高相比模型组较低，但差异无统计学意义，并且相比中药预防组升高，差异具有统计学意义，出现这种结果的原因可能是MetS模型大鼠8周的造模使得血管内皮功能受损害程度较初期更为严重，后期的干预无法达到和前期预防相同的水平。3个时间点的模型组大鼠VCAM-1水平均较正常组升高，差异均具有统计学意义，第4周末和第8周末的中药预防组的VCAM-1浓度的升高虽低于模型组，但差异无统计学意义，第12周末的中药预防组的VCAM-1水平则明显低于模型组（P＜0.01），考虑可能为本次实验设定的中药汤剂给药浓度[26]不足以在前期（8周内）对VCAM-1的表达产生明显抑制。在第12周末的中药治疗组出现了和ICAM-1水平相似的结果，笔者认为前期预防效果良好正是体现了中医对MetS多种代谢异常聚集的疾病进行未病先治优势所在，其通过调理脾胃运化功能以改善血管功能，延缓重要脏器血管疾病的发生。

代谢综合征的中医病名讨论及对症、辨证治疗的相关研究仍处于以个人临床经验为主导的局面。本课题组认为脾失健运、肝失疏泄是代谢综合征的核心病机，肝气不舒、脾不散精、物不归正则化为痰、湿、瘀等病理产物，积聚于重要脏器，可进一步发展为心脑血管疾病；这与MetS的整个病程发展密切相关。临床上我们以疏肝健脾之柴芪汤对MetS患者进行干预，取得良好的疗效。其中柴胡具有疏肝解郁的功效，是治疗肝气不舒的代表药物，多种研究证实其具有抗炎作用[27]、其有效成分柴胡皂苷能抑制小鼠实验性高脂血症形成[28]。黄芪为补脾升阳的要药，其补气之力强，兼能通调水道，利湿驱邪。现代药理研究显示黄芪具有降糖作用[29]，还可显著降低高血压患者的炎症递质水平，有效防治和缓解动脉粥样硬化症状[30]。关于白术的功用，研究发现白术的主要成分为苍术酮、白术内酯及糖类，除了有利尿、抗炎的功效，还能减肥和降血糖[31]，与黄芪相配伍，可分别补益胸中及脾胃之气。枳实善破气除痞，化痰消积，其药理作用也包括调节胃肠运动、降低胆固醇等，对高脂血症患者的血脂及内皮功能有改善作用[32]。三七为活血化瘀止血的要药，研究表明三七中的活性成分可通过抑制NF-κB和MAPK通路从而起到抗炎的作用[33]。三七中的活血成分三七总皂苷可促进纤维酶活性、抑制血小板聚集，并降低全血黏度，达到显著抗凝的效果[34-35]。综上，整个组方的特点为补气理气为主、疏肝健脾并重，兼以活血化瘀、祛湿燥痰，从整体对代谢综合征尤其是证属肝郁脾虚的进行综合调理。

关于柴芪汤给药时机，本实验结果提示，自第9周起给药的中药治疗组的黏附因子表达虽低于模型组但并不明显，而自第1周开始给药的预防组则显现出升高程度明显低于模型组的结果。笔者认为正是由于ICAM-1和VCAM-1在动脉粥样硬化的初期主要表达在动脉内皮细胞表面，所以前期给药预防的效果明显优于后期干预，由此提示在临床上对于心脑血管疾病高危人群，应予以高度警惕并根据中医辨证进行适时干预，以延缓或减轻血管内皮病理改变从而达到防治MetS并降低心脑血管疾病风险的目的。