大株红景天注射液抗大鼠急性心肌缺血作用△

邱久文，李志强，王红颖，房宗宝，吴海波，林天泽，李美松

（1.通化玉圣药业有限公司，吉林 通化 134008；2.浙江大远智慧制药工程技术有限公司，浙江 杭州 310000）

大株红景天注射液为大株红景天Rhodiola kirilowii（Regel）Regel.干燥根及根茎经水提醇沉制备而成的中药注射剂，于2006年批准上市，是选用红景天单味药研制的治疗冠心病、心绞痛的临床急症注射用药，临床上还被广泛用于脑卒中、心衰、心肌梗死以及肺病、肝脏疾病的治疗。经研究表明大株红景天注射液的主要化学成分有红景天苷、酪醇及其苷类、黄酮类、苯丙素类、萜类、有机酸及其苷类等[1-2]。现代药理学研究证实，红景天提取物具有抗衰老、抗肿瘤、抗病毒、抗菌、抗缺氧、抗疲劳、抗辐射、抗氧化、镇痛、对中枢神经及内分泌系统双向调节等多种药理活性。实验研究发现红景天苷在实验性大鼠心肌缺血损伤方面具有保护作用，其抗心肌缺血损伤的作用机制主要是通过清除氧自由基、抗氧化抗凋亡、提高O型乙酰葡萄胺蛋白质水平以及促进缺血区血管新生减小梗死面积等途径[3-7]。为了验证大株红景天注射液在治疗冠心病心绞痛方面的作用，本文采用冠状动脉结扎法造成大鼠急性心肌缺血模型，观察大株红景天注射液的抗心肌缺血作用。

1 材料

1.1 受试药物

大株红景天注射液（通化玉圣药业有限公司），规格：5 mL／支，批号：3／1001150608。

1.2 仪器与试剂

小动物呼吸机（上海奥尔科特生物科技有限公司），INFINITE M1000全波长多功能酶标仪，MP150生理记录仪（美国BIOPAC公司），CTNI测定试剂盒（南京建成生物工程研究所，批号：201605），CK测定试剂盒（南京建成生物工程研究所，批号：201606），LDH测试盒（南京建成生物工程研究所，批号：201606），2，3，5-氯化三苯基四氮唑（TTC，南京建成生物工程研究所，规格：每瓶5 g，批号：201605）。以pH 7.4磷酸盐缓冲液配制成所需的溶液供染色用。

1.3 动物

SD大鼠40只，SPF级，雄性，220～260 g，购自浙江大学实验动物中心。动物合格证：SCXK（浙）2014-0001。

2 方法

2.1 动物分组

采用随机数字表法随机分为4组，假手术组（Sham Operation Group，SO）、模型对照组（Model Group，MG）、红景天低剂量组（HJTL）、红景天高剂量组（HJTH），每组10只。低剂量组和高剂量组分别每天尾静脉注射红景天原液2、4 mL·kg－1，连续7 d，假手术组和模型组给予等量的0.9%氯化钠溶液。

2.2 模型制备

将大鼠戊巴比妥（50 mg·kg－1）腹腔注射麻醉，仰卧位固定。二导联心电图动态监测。沿左侧第4、5肋间剪开左胸部皮肤，少量钝性分离胸肌，止血钳撑开胸廓，暴露心脏，将心脏轻轻挤出胸壁外，于肺动脉圆锥与左心耳之间，距左冠状动脉前降支起始部3 mm处穿线（用带有4-0缝合线的3／8弯针钩），结扎冠状动脉前降支，随后将心脏送回胸腔，挤出胸腔内空气，闭合胸腔缝合伤口并接呼吸机，恢复自主呼吸。假手术组大鼠的手术过程与上述相同，只穿线不结扎冠状动脉。

2.3 心肌梗死范围测定及组织学检测

模型大鼠连续给药7 d后，迅速摘离心脏，0.9%氯化钠溶液中清洗，除去血管等异物，每组取7只将心脏均匀切成5片，并置于1%TTC溶液中，37℃加热5 min，非梗死区呈鲜红色，梗死区呈灰白色。显微镜拍照，用图像处理软件Image Pro Plus统计梗死面积占心脏切片总面积的比重。每组取3只心脏进行组织学检测，心脏组织固定于10%福尔马林中，后用石蜡包埋。石蜡包埋的心脏组织制成石蜡切片后用苏木精-伊红染色法（HE染色）进行染色，以及进行免疫组织化学染色，于400X光学显微镜下观察采集图像。

2.4 心肌酶和心肌肌钙蛋白的测定

大鼠末次给药30 min后，腹腔注射戊巴比妥钠60 mg·kg－1麻醉，腹主动脉取血，3.2%枸橼酸钠抗凝，全血与抗凝剂体积之比9∶13，500 r·min－1离心10 min分离血浆，置于冰箱（－20℃）保存备用。按试剂盒方法测定血浆肌酸激酶（CK）、心肌肌钙蛋白（CTNI）、乳酸脱氢酶（LDH）活性，每组检测7份血样。

2.5 统计学处理

3 结果

3.1 急性心肌缺血大鼠心肌梗死面积的变化

冠状结扎前后大鼠心电图改变如图1所示。大鼠左心室薄片经TTC染色观察梗死发生的状况，在体视显微镜下观察表明，对照组梗死区域极小，模型组梗死区域较大，红景天低、高剂量组给药后心肌缺血梗死区域小于模型组。对梗死区域（白色部分）面积用Image Pro Plus软件进行统计，计算梗死区面积与整个心肌薄片面积的比值。结果表明，与模型组比较，低剂量和高剂量组的心肌梗死面积数值显著降低，具有统计学差异（P＜0.05，P＜0.01），见图 2、图3。

图1 冠脉结扎前后大鼠心电图改变

图2 不同浓度大株红景天注射液对大鼠急性心肌梗死面积区域影响 （n＝7）

3.2 心脏组织HE和免疫组化染色后的观察结果

大鼠左心室切片经HE染色观察组织形态，在光学显微镜下观察表明，假手术组正常心肌细胞排列整齐，胞质染色均匀，核成圆形或椭圆形，染色质分布均匀，模型组梗死区域出现大片无核区域。黏附分子CD11b免疫组织化学结果显示模型组梗死区域中性粒细胞表面CD11b表达明显增多，炎性细胞浸润严重。红景天低、高剂量组给药后可逆转该现象。结果表明，与模型组比较，低剂量和高剂量组可抑制急性心肌缺血大鼠炎性细胞浸润，减少心肌梗死面积，如图4、图5所示。

图3 不同浓度大株红景天注射液对大鼠急性心肌梗死面积比率的影响（n＝7）

3.3 不同浓度大株红景天注射液对心肌缺血大鼠血浆心肌肌钙蛋白CTNI影响

实验结束时，各组大鼠腹主动脉采血，分离血浆，测定大鼠血浆心肌肌钙蛋白CTNI水平。结果可见，与假手术组比较，模型组的心肌肌钙蛋白数值明显升高（P＜0.01）；与模型组比较，低剂量组的血浆肌钙蛋白水平降低，但无统计学差异（P＞0.05），高剂量组的血浆肌钙蛋白水平显著降低，具有统计学差异（P＜0.01），结果见图6。

3.4 不同浓度大株红景天注射液对大鼠血浆肌酸激酶CK的影响

实验结束时，各组大鼠腹主动脉采血，分离血浆，测定各组大鼠血浆肌酸激酶CK。结果可见，与假手术组比较，模型组的肌酸激酶CK明显升高（P＝0.313 0）；与模型组比较，大株红景天低、高剂量组的心肌酶水平有降低趋势（P＝0.549 7，P＝0.094 4），并呈现出量效相关性，结果见图7。

3.5 不同浓度大株红景天注射液对大鼠血浆乳酸脱氢酶LDH的影响

实验结束时，各组大鼠腹主动脉采血，分离血浆，测定各组大鼠血浆乳酸脱氢酶LDH。结果可见，与假手术组比较，模型组的乳酸脱氢酶LDH数值明显升高（P＝0.056 1）；与模型组比较，大株红景天低、高剂量组的乳酸脱氢酶水平呈现出降低的趋势（P＝0.439 7，P＝0.330 5），结果见图8。

图4 不同浓度大株红景天注射液对心肌缺血大鼠左心室横截面HE及CD11b染色情况的影响（n＝3）

图5 不同浓度大株红景天注射液对心肌缺血大鼠左心室组织中炎性细胞聚集作用比较（n＝3）

图6 不同浓度大株红景天注射液对心肌缺血大鼠血浆心肌肌钙蛋白CTNI的影响（n＝7）

图7 不同浓度大株红景天注射液对心肌缺血大鼠血浆肌酸激酶CK的影响（n＝7）

图8 不同浓度大株红景天注射液对心肌缺血大鼠血浆乳酸脱氢酶LDH的影响（n＝7）

4 讨论

大鼠心肌缺血造模方法很多，经典的造模方法为结扎大鼠心肌冠状动脉左前降支，造成心肌缺血模型。冠状动脉结扎法能人为模拟临床心肌梗死过程中冠状动脉梗死，其梗死部位、分布范围相对一致，病理生理、生化改变与临床心肌梗死相似[8]。本实验采用手术结扎大鼠冠状动脉左前降支方法制做急性心肌缺血模型。结果显示，与模型组比较，低剂量和高剂量组的心肌梗死面积数值明显降低，具有统计学差异（P＜0.05，P＜0.01），说明大株红景天注射液在低剂量和高剂量组能有效降低心肌梗死大鼠的梗死面积。大鼠左心室切片经HE染色观察组织形态，观察到模型组梗死区域出现大片无核区域，而大株红景天注射液干预后可改善这一现象，进一步确证了大株红景天注射液能有效降低心肌梗死大鼠的梗死面积。免疫组化结果显示，与模型组相比，低剂量和高剂量的心肌梗死区域中性粒细胞表面黏附分子CD11b表达明显降低，显著改善炎性细胞浸润水平，并且具有统计学差异（P＜0.01），说明红景天注射液在低剂量和高剂量能够有效抑制心肌梗死大鼠的炎性细胞浸润。

CTNI在预测MIS、评估溶栓效果、鉴别不稳定性心绞痛等多个领域有重要价值，常被作为诊断心肌损伤的标志物，具有高灵敏度、高特异性、出现早、持续时间长的特点[9-10]。心肌缺血损伤时，由于自由基堆积和Ca2＋超载，损伤了细胞膜和线粒体，CTNI可通过破损的细胞膜弥散进入细胞间质，随之进入血管和淋巴管内引起血浆中 CTNI的增加[11]，因此观察药物对心肌CTNI的影响，是判断其是否具有抗心肌缺血损伤作用的一个主要指标。本实验中，与模型组比较，低剂量组的血浆肌钙蛋白水平低于模型组，但无统计学差异（P＞0.05），高剂量组的血浆肌钙蛋白水平显著降低，具有统计学差异（P＜0.01），说明大株红景天注射液在高剂量组浓度下能够有效减轻心肌缺血大鼠心肌损伤。

LDH是一种糖酵解酶，是体内能量代谢过程中的一种重要的酶，此酶几乎存在于所有的组织中，当少量组织坏死时此酶即释放入血，使其在血液中的活力升高[12]。CK通常存在于心脏、肌肉、脑等组织的细胞浆和线粒体中，是一个与细胞内能量转运、肌肉收缩、ATP再生有直接关系的重要激酶，肌酸激酶在临床诊断中有重要的意义，在各种病变包括肌肉萎缩和心肌梗死发生时血浆中的肌酸激酶水平迅速升高[13]。本实验中，与模型组比较，大株红景天注射液低、高剂量组均能一定程度地降低CK和LDH水平，其中大株红景天高剂量组CK和LDH下降趋势较大株红景天低剂量组更为明显，可见大株红景天对心肌梗死大鼠血清LDH、CK的影响有一定的量效关系。

综上所述，大株红景天注射液在高剂量时能够有效减少急性心肌梗死大鼠的心肌梗死面积，显著改善心肌梗死区域炎性细胞浸润，显著降低血浆心肌肌钙蛋白CTNI的水平，并能降低血浆心肌酶CK和LDH的活力，高剂量浓度（4 mL·kg－1）对急性心肌缺血大鼠有良好的保护作用。