基于psbA-trnH序列的芦根及其混伪品DNA条形码鉴定△

韩正洲，吴正军，魏伟锋，陈新连，林余霖，王瑀*

（1.华润三九医药股份有限公司，广东 深圳 518110；2.中国医学科学院北京协和医学院药用植物研究所国家中医药管理局中药资源保护重点研究室，北京 100193；3.国家中成药工程技术研究中心，辽宁 本溪 117004）

芦根为禾本科植物芦苇Phragmites communis Trin.[《Flora of China》收录本种为Phragmites australis（Cav.）Trin.ex Steud.]的新鲜或干燥根茎，全年均可采挖，除去芽、须根及膜状叶后入药[1]。芦根为临床常用中药，全国各地均产[2]，具有清热泻火、生津止渴、除烦、止呕、利尿的功效，用于热病烦渴、肺热咳嗽、肺痈吐脓、胃热呕哕、热淋涩痛[1]。芦根最主要的化学成分为多糖，其次为黄酮、甾体、蒽醌、生物碱等多种成分，临床研究发现芦根主要具有保肝、抗菌等功效，对感冒、支气管炎、口臭、急性扁桃体炎、肺脓疡等疾病具有良好的治疗效果[3]。临床应用中，芦根药材混伪品主要为同科的芦竹Arundo donax Linnaeus、芒Miscanthus sinensis Anderss.、菰 Zizania latifolia（Griseb.）Stapf等的根茎，芦竹的根茎具有清热泻火、生津止渴、除烦、利尿消肿等功效，主治热病烦渴、骨蒸发热、吐血、热淋、小便不利、风火牙痛等症[4]，《民间常用草药汇编》记载芒的根茎能通气血，治妇女干病[5]；菰的根茎有清热解毒、除烦止渴的功效，主治消渴、心烦、小便不利、小儿麻疹高热不退、烧烫伤等[6]，在广东地区用量较大，并常与芦根互相替补使用或混淆使用[7]。因芦根和芦竹根均有清热泻火、生津止渴的功效，加之药材性状相似，临床应用常出现混淆和误用[8]。另外，芦苇、芦竹和芒的生长习性相似，喜河岸、池塘、沼泽及湿润地生长，并且植物形态非常相似，导致芦根药材采收时，出现植物辨认不清、药材来源混乱等情况[9]。

DNA条形码自2003年[10]被提出后就受到国际广泛关注。DNA条形码鉴定是利用基因组中一段公认相对较短的序列对物种进行识别鉴定，可有效弥补传统鉴别的局限。该技术物种鉴定效率高、方法简单，不受外界环境、样品形态和材料部位的限制，能够满足不同行业及不同科研背景工作者对中药材鉴定的要求，为中药材流通领域及食品药品相关行业的监管提供了强有力的工具[11-12]。Chen等在大量实验研究基础上建立了以ITS2为主、psbA-trnH为辅的植物类药材鉴定系统[13]。芦根的混伪情况会影响芦根的品质和临床用药安全，需要一种快速、准确的鉴定方法对该药材的鉴定提供支持。目前，已有研究从形态、性状、生药学特征等方面对芦根及其混伪品进行区分[7，9，14]，本研究运用psbA-trnH序列对芦根及其混伪品进行鉴定，旨在为该药材的市场监管、用药安全和临床疗效等方面提供参考。

1 材料

研究材料包括4个物种40份样品，其中芦根及其基原植物样品共18份，分别来源于安徽亳州药市、河北安国药市等，样品经中国医学科学院药用植物研究所林余霖研究员鉴定，均为禾本科植物芦苇P.communis的根。从GenBank下载的芦苇序列4条，混伪品序列18条，具体样品信息详见表1。

表1 芦根及其混伪品样品信息表

续表1

2 方法

2.1 DNA提取

按照中药材DNA条形码分子鉴定法标准操作流程（SOP）提取芦根及其基原植物的DNA[15]，芦根干燥样品取样量为40 mg，基原植物干燥叶片为20 mg，药材样品研磨后用核分离液 [100 mmol·L－1Tris-HCl（pH 8.0），20 mmol·L－1EDTA（pH 8.0），0.7 mmol·L－1NaCl，2%PVP 40，0.4% β-巯基乙醇]洗涤3次，用植物DNA提取试剂盒（Bioteke Co.，China）提取DNA，按操作说明进行。药材类样品65℃水浴90 min，叶片类样品65℃水浴30 min。

2.2 PCR扩增及测序

参照Chen等[16]的研究方法，对psbA-trnH序列进行扩增，正向引物PA：5′-GTTATGCATGAACGTAATGCTC-3′；反向引物 TH：5′-CGCGCATGGTGGATTCACAATCC-3′。扩增程序：94℃ 5 min；94℃1 min，55℃ 1 min，72℃ 1.5 min，30个循环；72℃7 min。PCR反应体积为25μL，包括12.5μL 2×Taq Master Mix（北京艾德莱生物科技有限公司，北京），正反向引物各取1μL，DNA模板2μL，用8.5μL ddH2O补足体积至25μL[15]。设置未加模板DNA的PCR反应为阴性对照，PCR扩增产物由中国农业科学院开放实验室进行双向测序。

2.3 数据处理

测序得到的峰图利用CodonCode Aligner V 5.1.5进行比对和拼接，去除引物区，获得严格一致性序列，然后将所有序列用MEGA 6.0（Molecular Evolutionary Genetics Analysis）进行分析比对，并基于Kimura-2-parameter（K2P）双参数模型计算遗传距离，用邻接（NJ）法构建系统聚类树。

3 结果与分析

3.1 芦根psbA-trnH序列特征

芦根不同来源样品序列共有22条，序列长度为482～483 bp，G＋C含量为37.7%～37.8%，种内变异位点 2个，第 66、67位点均为 C-G变异，第418位点为插入／缺失，有 2种单倍型，Y17045MT02为1种单倍型，其余21条序列为1种单倍型。主导单倍型序列见图1，芦根psbA-trnH序列峰图特征如图2所示。

图1 芦根psbA-trnH主导单倍型序列

图2 芦根psbA-trnH主导单倍型序列峰图

3.2 芦根与其混伪品psbA-trnH序列种间变异分析

将芦根与其各混伪品的psbA-trnH序列的单倍型进行比对，共有26个变异位点，详见图3。

将所有40条psbA-trnH序列进行比对，计算得出芦根psbA-trnH序列种内K2P距离为0～0.004 2，芦根与其混伪品的种间最小K2P距离0.008 3，大于芦根种内最大K2P距离，见表2，因此psbA-trnH序列可以将芦根及其混伪品区分开。

图3 芦根及其混伪品的psbA-trnH序列种间变异位点

表2 芦根及其混伪品psbA-trnH序列种内种间K2P距离

3.3 芦根及其混伪品的psbA-trnH序列聚类分析

芦根P.communis有2种单倍型，这2种单倍型序列各选1条，芦竹Arundo donax只有1个单倍型，选择1条序列，菰Zizania latifolia和芒Miscanthus sinensis也各有2种单倍型，使用全部序列，基于psbA-trnH序列用MEGA 6.0构建芦根及其混伪品NJ系统聚类树（见图4），从NJ树中可以看出，芦根样品单独聚为一支，支持率为99%，其混伪品各自聚为一支。

图4 基于psbA-trnH序列构建的芦根及其混伪品的NJ树

4 讨论

4.1 芦根样品的DNA提取

成功提取药材基因组DNA是中药材DNA条形码鉴定技术的前提和基础。芦根样品为植物的根茎，含多糖、多酚类成分，研磨时多酚极易氧化成醌类[11]，使DNA带有一定颜色，在纯化过程中很难去除，影响后续的PCR反应。因此，为了提高芦根样品的DNA提取效率，本研究对试剂盒法进行以下改良：提取药材DNA时加大样品量；加大聚乙烯吡咯烷酮的使用量；用核分离液洗涤多次；降低水浴温度，适当延长水浴时间，在56℃水浴放置8～12 h，使得细胞充分裂解，DNA充分释放到缓冲溶液中。芦根药材和基原植物样品采用改良后的DNA提取试剂盒法均成功得到其基因组DNA。

4.2 应用psbA-trnH条形码序列对芦根及其混伪品的鉴定

芦根混伪品与芦根形态相似，传统鉴别比较依赖专业人员，混用误用严重影响芦根的质量安全和临床疗效。本研究从各地及GenBank上最终得到芦根及其混伪品序列共40条，运用植物试剂盒成功提取药材和基原植物的DNA，因使用ITS2序列通用引物扩增困难，本研究使用psbA-trnH序列通用引物进行扩增。结果显示，芦根种内较为保守，仅2个变异位点。芦根与其混伪品psbA-trnH序列变异位点为26个，种间K2P距离为0.008 3～0.036 1，种间最小遗传距离大于芦根种内最大遗传距离。NJ树显示芦根样品聚为一支，支持率为99%，其混伪品也各自聚为一支，可以明显鉴别开芦根及其混伪品。由此可见，psbA-trnH序列可准确鉴定芦根及其混伪品，有利于保障芦根的质量安全和临床疗效，并为保证药材在市场上的安全流通和质量监管提供参考。