HS-SPME-GC-MS测定食醋中羟甲基糠醛衍生物的研究

王 鑫,李丹丹,李 婷,陈 峰,2,3,肖安风,2,3,倪 辉,2,3*

(1.集美大学 食品与生物工程学院,福建 厦门 361021;2.福建省食品微生物与酶工程重点实验室,福建 厦门 361021;3.厦门市食品生物工程技术研究中心,福建 厦门 361021)

羟甲基糠醛(hydroxymethyl furfural,HMF)是食品中常见的成分[1-2],已经有一些学者对羟甲基糠醛衍生物进行了研究,5-甲基糠醛是一种允许使用的食品添加剂[3],糠醛在我国是一种允许使用的食品用合成香料[4],但过量使用存在安全隐患,大鼠经口半数致死量为65 mg/kg;此外,糠醛还具有强烈的刺激性和麻醉作用,吸入后可能出现刺激呼吸道等生理反应[5]。一定剂量的糠醛被机体吸收后,会对肝脏、肾脏、心脏等器官产生不良影响[6]。

食醋是一种人们常用、滋味丰富的酸性调味品。根据发酵方式不同,食醋可分为固态发酵食醋和液态发酵食醋[1]。食醋中含有一定量的5-羟甲基糠醛[2,7]。近年来,周婷婷等[8]通过高效液相色谱(high performanceliquid chromatography,HPLC)法测定老陈醋中羟甲基糠醛的含量。阎玉林[9]通过固相微萃取串联气质联用法(solid-phasemicroextraction/gas chromatography-massspectrometer,SPME/GC-MS)从食醋中鉴定出糠醛和5-甲基糠醛等成分。周钰欣等[10]通过GC-MS从岐山醋、北京米醋、镇江陈醋、山西陈醋和海天陈醋五种固态发酵食醋中鉴定出糠醛、5-甲基糠醛和2-乙基-1-己醇等成分。但是目前对食醋中羟甲基糠醛衍生物的研究相对还较少,还不清楚各类食醋中羟甲基糠醛衍生物的含量差异及其对消费者健康的影响。

目前,国内外测定羟甲基糠醛类物质的方法主要有分光光度法[11]、紫外光谱法[12]、高效液相色谱法[13]、气相色谱-质谱法[14]和液相色谱-串联质谱法[15]等;其中最常用的方法是气相色谱-质谱联用方法。因此,本实验利用SPME/GC-MS测定食醋中羟甲基糠醛衍生物,并开展方法验证实验,用其分析常见食醋中羟甲基糠醛衍生物的含量,为分析各类食醋中羟甲基糠醛衍生物的含量差异提供理论基础。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

环己酮(纯度≥99.5%)、正己烷(纯度≥99%)、糠醛(纯度≥99%)、5-甲基糠醛(纯度≥99%)、2-乙基-1-己醇(纯度≥99%):美国Sigma-Aldrich公司;羟甲基糠醛(≥99%):南京爱里凯德化工有限公司;盐酸、乙酸、乳酸、无水乙醇、氢氧化钠(均为分析纯):国药集团上海化学试剂有限公司。

永春香醋、永春老醋、海堤香醋、恒顺香醋、紫林山西陈醋:均购于厦门本地商场。

1.2 仪器与设备

QP-2010 Plus气相色谱质谱串联仪和Rtx-5MS(60 m×0.32 mm×0.25μm)色谱柱:日本岛津公司;手动SPME进样器、75μm DVB/CAR/PDMS萃取头:美国Supelco公司;SHZ-IIID循环水真空泵:上海亚荣生化仪器厂;ZXRD-B5210鼓风干燥箱:上海智诚分析仪器公司;HH-1数显恒温水浴锅:常州国华电器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 样品前处理

取5 mL样品溶液置于50mL萃取瓶中,加1μg/mL的环己酮10μL作为内标,再加入25 mL水,然后置于60℃水浴中平衡5 min后,将已老化的萃取头插入装有样品的萃取瓶中,吸附20 min。然后将萃取头插入气相色谱进样口中解吸3 min,进行GC-MS分析(重复3次)。

1.3.2 气相色谱质谱联用仪的分析操作条件

气相色谱条件:色谱柱为Rtx-5MS(60 m×0.32 mm×0.25μm),载气为高纯氦气(He)(纯度99.999%),柱流量为3 mL/min,分流比为1∶5。升温程序:程序升温,进样口温度为250℃,初始温度在40℃保持1min,然后以5℃/min升温至220℃保持1.5min。

质谱条件:离子源温度为250℃,电离方式为电子电离(electron ionization,EI),电离能量为0.85 kV,质谱接口部分温度为250℃,SCAN模式扫描,离子碎片扫描范围在33～450 m/z之间。

1.3.3 羟甲基糠醛衍生物的鉴定

对挥发性成分共采用了三种方式进行定性:

(1)利用质谱数据库(NIST08、NIST08s、FFNSC1.3)进行相似度检索、特征峰分析;

(2)通过正构烷烃计算保留指数并参考有关文献报道的保留指数进行综合定性[16-17];

(3)与标准品的特征离子碎片和参考保留指数进行比较定性[18-20]。

1.3.4 标准线性曲线建立

定量方法采用加内标校正的外标法进行定量,内标为0.33μg/mL的环己酮溶液。根据1.3.2中给出的色谱条件、升温程序和质谱条件,在质谱选择性离子监测(selected ion monitoring,SIM)模式下进行分析。以糠醛、5-甲基糠醛和2-乙基-1-己醇含量为1μg/mL、2μg/mL、5μg/mL、25μg/mL、50μg/mL、100μg/mL、200μg/mL对糠醛、5-甲基糠醛、2-乙基-1-己醇和环己酮峰面积比绘制标准工作曲线。

1.3.5 方法检测限和定量限

把最低浓度的混合标准品溶液再向下稀释,得到一系列更低浓度的混合标准品溶液,直到信噪比≥3时的标准品浓度,即为检测限[21],而信噪比≥10时的标准品浓度是定量限[22]。取5 mL空白样品,添加1μL混合标准溶液(5-甲基糠醛、糠醛和2-乙基-1-己醇混合标准品溶液,10μg/mL)和10μL内标(环己酮溶液,1μg/mL),逐倍稀释至信噪比≥10和信噪比≥3。

1.3.6 方法回收率

由于乙酸在食醋中含量较高,在萃取头上会发生竞争吸附现象,抑制其他组分的吸附,因此,需要将食醋样品中和至pH=7后再进行回收率实验[23]。分别向中和后的永春老醋中添加混合标准品溶液25μg/mL、50μg/mL、100μg/mL和200μg/mL,然后把加标后的样品按照与样品相同的处理方法处理后上机测定,每个浓度平行测定3次,以食醋初始浓度为空白计算测定得到的羟甲基糠醛衍生物含量,计算回收率,其计算公式如下:

1.3.7 方法准确度和精密度

通过日内和日间变化来评价定量方法的准确度和精密度,从而反映样品的稳定性[24]。日内变化是同一天测定同一个一定浓度的混合标准品溶液3次,计算含量和误差。日间变化是连续3天测定同一个混合标准品溶液,每天测定一次,计算含量和误差。试样平均测量值和理论含量的比值关系反映准确度,计算相对标准偏差,反应精密度。

1.3.8 实际样品的测定

挥发性成分通过相应的标准曲线进行浓度定量。由于山西紫林陈醋和恒顺香醋中部分成分超过标准曲线线性范围,所以先将其稀释20倍后测定。

1.3.9 数据处理

参照相关文献,利用通过Excle 2013(微软,美国)和SPSS 19.0(IBM,美国)软件进行统计学分析。

2 结果与分析

2.1 食醋样品中羟甲基糠醛衍生物的鉴定及标准曲线制定

五种食醋样品中的挥发性成分经过GC-MS分析,得到食醋样品中挥发性成分的总离子流色谱图,如图1所不。通过数据库信息检索、计算保留指数与标准品保留指数及参考文献对比,鉴定出糠醛、5-甲基糠醛和2-乙基-1-己醇共3种羟甲基糠醛衍生物,其鉴定结果及标准曲线如图1和表1所不。方法检测限和定量限结果见表1,糠醛的检测限为3.33×10-2μg/L,5-甲基糠醛的检测限为3.33×10-1μg/L,2-乙基-1-己醇的检测限为4.17×10-6μg/L;定量检测限在6.67×10-1-3.33 μg/L之间。ZHU H等[25]建立HS-SPME/GC-MS分析方法检测山西老陈醋中的挥发性成分,发现糠醛、5-甲基糠醛检测限分别为0.352μg/L和1.174μg/L;定量限分别为0.150μg/L和0.500μg/L。本方法的检测限和定量检测限与相关文献报道的值相似。

图1 处理过的五种食醋样品中挥发性成分GC-MS分析总离子流色谱图Fig.1 Total ion chromatogram of volatile components in the five treated vinegar samples analysis by GC-MS

表1 羟甲基糠醛衍生物的标准曲线、检测限和定量限Table1 Standard curve,limit of detection and limit of quantitation of hydroxymethylfurfural derivatives

2.2 方法回收率

食醋中羟甲基糠醛衍生物的回收率结果见表2。由表2所不,在食醋中,糠醛、5-甲基糠醛和2-乙基-1-己醇的平均回收率范围是81.62%～96.47%,表不方法准确度良好,本方法的加标回收率值与相关文献报道的值相似[26]。

表2 食醋中羟甲基糠醛衍生物的回收率Table2 Recovery rate of hydroxymethylfurfural derivatives in vinegar

2.3 方法准确度和精密度

准确度和精密度测定结果见表3,食醋中检测到的3种羟甲基糠醛衍生物的测定日内准确度在88.50%～94.05%,日间准确度在84.09%～93.17%,日内精密度相对标准偏差(relative standard deviation,RSD)≤4.36%,日间精密度RSD≤8.02%,林晓珊等[27]利用GC-MS测定调味品中的3种糠醛类物质,日内精密度RSD均＜5%,说明方法的准确度和精密度可靠,符合检测要求。

表3 方法准确度和精密度Table3 Accuracy and precision of the analysis method

2.4 实际样品的测定

运用SPME/GC-MS分析方法,对市售的几种不同来源的食醋等样品进行测定,结果见表4。利用该方法测得市售的五种食醋中,糠醛在恒顺香醋中含量最高,为7077.31μg/L,在永春老醋中含量最低,为179.23μg/L;5-甲基糠醛在紫林山西陈醋中含量最高,为684.27μg/L,在永春香醋中含量最低,为260.47μg/L;2-乙基-1-己醇在紫林山西陈醋中含量最高,为107.21μg/L,在恒顺香醋中含量最低,为62.13μg/L。结果表明,不同食醋中羟甲基糠醛的含量差异显著(P＜0.05)。

由表4可知,食醋中含有较高浓度的糠醛和5-甲基糠醛,尤其经过固态发酵的山西紫林陈醋和恒顺香醋中的糠醛和5-甲基糠醛远高于其他样品。固态发酵食醋发酵温度高,陈酿时间长,美拉德反应持续生成了大量风味物质,特殊的加工过程更加剧了美拉德反应,使糠醛类风味物质大量产生,而液态发酵食醋仅能产生少量的糠醛类风味物质[1]。ABRAHAMK等[28]根据毒理实验指出,正常人群每天食用不超过80～100 mg/kg体质量糠醛类物质(如5-甲基糠醛和糠醛),不会产生不良反应。以正常成年男性平均体质量为70kg计算,每天食用羟甲基糠醛衍生物5600～7000mg才会引起不良反应,以羟甲基糠醛衍生物含量较高的恒顺香醋和紫林山西陈醋计算,每天至少需要食用933.33L以上食醋才会引起不良反应,所以人们正常食用的醋量不会危害人体健康。

表4 几种市售样品中羟甲基糠醛衍生物的测定结果Table4 Determination results of hydroxymethylfurfural derivatives of several commercial samples

3 结论

本研究使用SPME/GC-MS方法分析市售食醋中羟甲基糠醛衍生物。从食醋中鉴定出了糠醛、5-甲基糠醛、2-乙基-1-己醇共3种羟甲基糠醛衍生物成分。这3种成分含量在3.33～666.67μg/mL范围内,标准曲线回归方程的R2＞0.990,加标回收率范围为81.62%～96.47%,日内准确度在88.50%～94.05%,日间准确度范围在84.09%～93.17%,日内精密度RSD≤4.36%,日间精密度RSD≤8.02%。使用该方法测定五种食醋样品中的羟甲基糠醛衍生物含量,其中糠醛含量范围在179.23～6 809.20μg/L之间;5-甲基糠醛含量在260.47～684.27μg/L之间;2-乙基-1-己醇含量在62.13～107.21μg/L之间。该方法能够准确分析各类食醋中羟甲基糠醛衍生物的含量差异。但未来还需要进一步对羟甲基糠醛衍生物的毒性进行研究,需要弄清羟甲基糠醛衍生物对人体的具体危害以及相应的机理,以得到相关毒理学数据,填补我国在这一领域的研究空白。