响应面法优化发酵蓝莓果醋发酵工艺条件

陈 曦,李国林,陈梦玉,黄道梅,孟繁博,郑秀艳,林 茂*

(1.贵州省农业科学院 现代农业发展研究所,贵州 贵阳 550006;2.贵州金农辐照有限责任公司,贵州 贵阳 550006)

蓝莓(blueberry)为杜鹃花科越橘属植物。蓝莓果实甜酸适度、口感佳,含有大量对人体健康有益的成分,其中富含芍药素、矮牵牛素等多种花青素成分,具有良好的抗氧化能力。蓝莓中所含有的单宁类物质可以有效抑制消化系统的不良症状[1-2]。1989年我国开始从美国、加拿大等地引种70余个品种蓝莓,2008年以后贵州种植蓝莓面积快速增长,据2015年统计数据,仅贵州黔东南苗族侗族自治州累计种植蓝莓达12.8万km2,成为中国最大人工种植蓝莓地区,占全国种植面积的1/3[3]。蓝莓具有不易保藏、产业化和利用率低的特点[4-5],因此,贵州蓝莓深加工迫在眉睫。蓝莓发酵制品的开发一直存在生产工艺不够完善,发酵质量不够稳定,发酵效率低的问题[6-9]。鉴于此,本研究利用响应面法对蓝莓果醋的醋酸发酵工艺条件进行优化,从而确定蓝莓果醋的最佳发酵条件。果醋发酵工艺条件经优化后不但具有果醋的风味和口感,还保留了蓝莓本身的花青素、维生素、氨基酸等丰富的营养成分。使得消费者更易接受的同时扩大消费领域,也为蓝莓果醋的开发与工业化生产研究提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

1.1.1 原料与菌株

蓝莓酒(酒精8.2%vol,pH 4.26):贵州省农产品加工研究所自制产品;沪酿1.01醋酸菌:上海酿造一厂。

1.1.2 化学试剂

葡萄糖、酵母膏、琼脂(均为生化试剂):生工生物工程(上海)股份有限公司;碳酸钙、氢氧化钠(均为分析纯):国药集团化学试剂有限公司。

1.1.3 培养基

醋酸菌试管斜面培养基[10]:酵母膏1%,葡萄糖1%,琼脂粉2%,碳酸钙1.5%,在121℃、0.1MPa条件下灭菌20min。

醋酸菌液体种子培养基[11]:酵母膏1%,葡萄糖1%,碳酸钙1.5%,在121℃、0.1 MPa条件下灭菌20 min。

1.2 仪器与设备

HT-24X2H恒温振荡培养器:上海五久自动化设备有限公司;SW-CJ-1C无菌工作台:无锡一净净化设备有限公司;LH-J80酒精度仪:上海樊克生物科技有限公司;雷磁PHS-25型酸度计:上海仪电科学仪器股份有限公司。

1.3 方法

1.3.1 蓝莓醋加工工艺流程及操作要点

操作要点:按比例加入无菌水调整成不同酒精度、不同pH值的蓝莓酒后,巴氏灭菌温度为75℃,维持15 min,进行灭菌处理,将体积分数20%的蓝莓酒装入250 mL锥形瓶中,按体积分数15%的接种量接入醋酸菌活化液,用纱布封口,在转速180 r/min、温度为30℃条件下进行醋酸发酵,时间5 d,利用60Co-γ辐照剂量为1 000 Gy,且以3～4 Gy/min的剂量率进行辐射,辐射后陈酿15 d,用膜过滤设备进行澄清处理后,在121℃条件下进行超高温瞬时灭菌30 s。

1.3.2 蓝莓果醋的醋酸发酵条件优化

(1)单因素试验

通过前期预实验结果,拟采用初始pH值(3.0、3.5、4.0、4.5、5.0、5.5)、初始酒精度(5%vol、6%vol、7%vol、8%vol、9%vol)、发酵时间(1 d、2 d、3 d、4 d、5 d、6 d、7 d)、转速(160r/min、180r/min、200r/min、220 r/min)、发酵温度(26 ℃、28℃、30℃、32℃、34℃)这5个影响因素进行单因素试验,以蓝莓果醋醋酸产量为评价指标。筛选出对蓝莓果醋影响较大的因素进行响应面优化试验,所做试验均重复3次。

(2)响应面试验设计

在单因素试验分析结果的基础上,以醋酸产量(Y)为响应值,选取4个影响较大的因素发酵时间(A)、初始pH值(B)、转速(C)、初始酒精度(D)进行蓝莓果醋醋酸发酵条件响应面优化试验,采用Design-Expert软件进行4因素3水平的响应面设计,将得到的试验数据进行二次多项回归拟合,所做试验均重复3次。响应面设计试验因素与水平见表1。

表1 Box-Behnken试验设计因素与水平Table1 Factors and levels of Box-Behnken experiments design

1.3.3 分析检测

pH测定:用pH计测定;酒精度测定:酒精密度瓶法,按国标GB/T 15038—2006《葡萄酒、果酒通用分析方法》的方法测定[12]。

醋酸产量的测定采用酸碱定法:取1 mL的发酵液于250 mL锥形瓶中,加入蒸馏水20 mL,用0.1 mol/L的NaOH标准溶液进行滴定至pH值8.2,并计算醋酸产量[13]。醋酸含量计算公式如下:

式中:X为样品中醋酸产量,g/100 mL;c为NaOH标准溶液浓度,mol/L;V0为空白实验消耗NaOH标准溶液体积,mL;V1为样品滴定时消耗NaOH标准溶液的体积,mL;0.06为1 mol NaOH相当于醋酸的质量,mg。

1.3.4 数据处理方法

单因素试验数据利用Origin8.0软件处理软件对进行处理和分析;响应面优化设计分析利用Design Expert17.0设计软件;显著性差异分析采用SPSS17.0统计软件进行。

2 结果与分析

2.1 发酵蓝莓果醋工艺优化单因素试验

2.1.1 初始pH值对蓝莓果醋发酵的影响

醋酸菌的繁殖速度和产酸能力受初始pH值的影响,初始pH值过高或过低都会抑制醋酸菌的生长,致使醋酸产量低[14]。由图1可知,当初始pH值在3.0及5.5时,醋酸菌生长缓慢,致使产酸效率低,总产量也低于其他初始pH值组。当初始pH值在3.5～4.5之间时,醋酸菌在此pH值范围内生长迅速,产酸能力强,积累的醋酸量较多。因此,响应面优化试验选取pH值为3.5～4.5。

图1 不同初始pH值对蓝莓果醋发酵的影响Fig.1 Effect of different initial pH values on blueberry vinegar fermentation

2.1.2 转速对蓝莓醋发酵的影响

醋酸菌作为好养微生物,在氧气充足时,其生理代谢活动旺盛,产醋酸量快。由图2可知,发酵0～5 d,转速越高,产酸变化幅度越大,说明转速越高,醋酸菌产酸能力越强;发酵到5～7 d,不同转速下,累计产酸量相差较小。因此,选择转速为180～220 r/min。

图2 转速对蓝莓果醋发酵的影响Fig.2 Effect of rotational speed on blueberry vinegar fermentation

2.1.3 初始酒精度对蓝莓果醋发酵的影响

据文献报道,初始酒精度越高,产酸量越多,但酒精度过高会抑制醋酸菌的生长,难以生产醋酸[15]。由图3可知,在酒精度达到9%vol时,醋酸菌生长受到抑制,产醋酸量低;在酒精度为5%vol时,由于酒精量不足以提供醋酸菌生产代谢,故产醋酸量也较酒精度在6%vol～8%vol低;酒精度为6%vol～8%vol时,不仅满足醋酸菌生长所需的营养物质,还保证了醋酸菌的生长代谢不受抑制,因此,选择酒精度为6%vol～8%vol。

图3 不同初始酒精度对蓝莓果醋发酵的影响Fig.3 Effect of different initial alcohol contents on blueberry vinegar fermentation

2.1.4 发酵温度对蓝莓果醋发酵的影响

图4 发酵温度对蓝莓果醋发酵的影响Fig.4 Effect of fermentation temperature on blueberry vinegar fermentation

微生物乃有在适宜温度下,生长速度才最快,代谢时间最短[16]。醋酸菌在温度过低时发酵效率低,产酸量少,温度过高的话,会造成醋酸菌老化加快,醋酸产量低[17]。由图4可知,随着发酵时间的延长,在不同温度条件下,醋酸菌产酸量逐渐增加,在30℃条件下发酵,最终醋酸产量最高,为5.48 g/100 mL,经数据分析,差异性显著(P＜0.05)。因此,选择30℃作为最适发酵温度。

2.2 Box-Behnken Design响应面设计

采用Design Expert 17.0软件进行4因素3水平的响应面设计。固定醋酸发酵温度为30℃,根据上述单因素试验结果,选择发酵时间为4～6 d,以发酵时间(A)、初始pH值(B)、转速(C)、初始酒精度(D)4个因素为自变量,醋酸产量(Y)为响应值,设计4因素3水平Box-Behnken试验方案,响应面设计试验结果见表2,方差分析见表3。利用Design Expert软件对表2进行回归分析,得到醋酸产量对自变量发酵时间(A)、初始pH值(B)、转速(C)及初始酒精度(D)的二次多项回归方程为:

表2 响应面试验设计及结果Table2 Design and results of response surface experiments

表3 回归模型方差分析Table3 Variance analysis of regression model

由表3可知,该模型P＜0.000 1,回归模型方程极显著;失拟项P=0.054 2＞0.05,不显著,表明该方程合理可行;决定系数R2=0.956 5,模型的校正决定系数R2Adj=0.912 9,说明该模型能解释91.29%响应值的变化。

模型方程的一次项A、D的P值均＜0.05,说明发酵时间和初始酒精度对结果有显著的影响,且一次项各因素对醋酸产量影响的大小顺序为:初始酒精度(D)＞发酵时间(A)＞转速(C)＞初始pH值(B)。二次项A2、B2、C2、D2的P值均＜0.01,具有极高的显著性,说明醋酸产量的变化相对复杂,发酵时间、初始pH值、转速、初始酒精度对醋酸产量的影响不是简单的线性关系,响应面效应显著。该回归方程的拟合度和可信度均较好,可用于蓝莓果醋醋酸产量的理论预测[18]。

经软件Design Expert7.0优化,分析得到蓝莓醋酸发酵的最佳工艺条件为:发酵时间5.13 d、初始pH值4.01、转速202 r/min、初始酒精度6.8%vol,根据模型预测得到的理论最大醋酸产量为5.75 g/100 mL。

图5 发酵时间、初始pH值、转速和初始酒精度的交互作用对蓝莓果醋发酵影响的响应面和等高线Fig.5 Response surface plots and contour line of effects of interaction between fermentation time,initial pH value,rotational speed and initial alcohol content on blueberry vinegar fermentation

2.3 验证试验

为了验证模型预测的可靠性,同时考虑到实际操作的便利,将最佳工艺条件修正为:发酵时间5 d、初始pH值4.0、转速202 r/min、初始酒精度7.0%vol,在最佳处理条件下,测得醋酸产量为5.63g/100mL。实测值与预测值误差为3.82%,证明响应面法优化的蓝莓果醋发酵工艺是可行的,具有实际应用价值。

3 结论

根据单因素试验和Box-Benhnken响应面优化试验,优化的醋酸发酵工艺条件为发酵时间5 d、初始初始pH值4.0、转速202 r/min、初始酒精度7.0%vol、发酵温度30 ℃。在本试验范围内建立的模型准确有效,可用来预测设定条件范围内及其周围的蓝莓果醋发酵工艺参数。在此优化条件下发酵所得蓝莓果醋的醋酸产量为5.63 g/100 mL,且具有醋香浓郁、蓝莓典型香气和色泽的特点。优化发酵工艺后的蓝莓果醋为后续研究辐照陈香奠定基础。