基于食品污染物引起DNA损伤的电化学检测方法研究

廖天录

甘肃工业职业技术学院 甘肃 天水 741025

1.引言

食品在种植或饲养、生长、收割或宰杀、加工、贮存、运输、销售到食用前的各个环节中，由于环境或人为因素的作用，可能使食品受到有毒有害物质的侵袭而造成污染，这个过程就是食品污染。大量的环境污染物质可以通过食物链进入人体，对机体遗传物质DNA造成损伤。脱氧核糖核酸(DNA)是生物体内的重要组成物质,是遗传信息的主要载体,与生物的生长、发育、繁殖等正常生命活动及突变、癌变等异常生命活动有关,因此, 维护DNA结构的完整性对生命体十分重要。而外界环境和生物体内部的各种因素经常会引起DNA结构的异常变化，造成DNA的损伤。如果DNA的损伤不能及时得到修复，其在复制过程中会出现基因突变，对体细胞来说可能会引起癌症等疾病，对生殖细胞来说可能会引起染色体失常，造成后代畸形或某些遗传性疾病[1]。

随着先进的化学合成方法和技术的发展，每年有数百万种新的化学物质可能被使用在药物的、农业的、身体的、饮食的各个方面，但到目前为止，很多化学品对人体健康的影响并不十分清楚。许多环境污染物或药物分子在肝脏细胞色素P450酶作用下的代谢产物也会与DNA碱基形成加合物，引起DNA的损伤[2]。如果能够开发出灵敏快速简便的分析方法来检测DNA的损伤，就可以比较方便地筛选出对人体有毒有害的化学品，从而降低其危害人体健康的可能性。所以，发展灵敏、快速、简便的分析方法检测DNA损伤，对疾病早期诊断、环境保护、药物筛选,以及化合物毒性检测等具有重要的意义。

层层膜自组装法作为一种相对新的DNA膜形成方法，和其他成膜方法相比，有明显的优点，能根据预先设计的膜结构可以精确控制膜的成分和厚度，并且制备简便和多功能[3]。制备的多层膜能够保持生物大分子的二级结构和生物活性。实验中利用阿霉素作为电活性指示剂与双链DNA（dsDNA）的特殊相互作用（主要是嵌入作用和沟槽结合作用）来检测环氧苯乙烯（SO）对天然DNA损伤的报道很有限。阿霉素, 通常以盐酸盐的形式存在，又名盐酸阿霉素或盐酸多柔米星，英文名：Adriamycin Hydrochloride（ADM）。其结构式见图1。结构中既含有脂溶性的蒽环配基，又有水溶性的柔红糖胺；并有酸性酚羟基和碱性氨基。阿霉素为橙红色疏松块状物或粉末，易溶于水，是一类在临床上广泛使用的具有广谱高效活性的蒽环类抗癌药物。

图1 阿霉素的结构

实验中选择环境污染物环氧苯乙烯被作为DNA的损伤剂。环氧苯乙烯（Styrene oxide, SO）作为一种可能人类致癌物质，苯乙烯在细胞色素P450单加氧酶作用下的主要代谢物，长期的暴露却会造成染色体畸变、姊妹染色单体交换、微核生成等[4]。

2.实验部分

2.1 试剂

聚乙烯亚胺（PEI, MW～1800）购于Alfa Aesar公司；小牛胸腺DNA（北京华美生物工程公司），DNA储备液的制备：于实验前将1mg 的DNA溶于1mL pH 7.1的Tris-HCl中并置过夜24h后使用。用UV谱测定CT-DNA：A260/A280大于1.8，表明DNA中不存在干扰测定的蛋白质。环氧苯乙烯（Styrene oxide, SO, 97﹪）购于Alfa Aesar公司；阿霉素（Adriamycin Hydrochloride, ADM）购于中国汕头华明药业公司；铁氰化钾（K3Fe(CN)6，北京化学试剂公司），亚铁氰化钾（K4Fe(CN)6，北京化学试剂公司），氯化钾（KCl，天津市化学试剂一厂）；二次蒸馏水用于全部实验。试剂均为分析纯，水为二次蒸馏水，储存于4℃。每次试验前用高纯氮气除氧。除DNA损伤实验外所有实验均室温(20±2℃)下进行。实验是在0.1M磷酸盐缓冲液（pH=7）进行DPV测试。

2.2 仪器

电化学实验采用三电极体系，其三电极系统是用裸玻碳电极或修饰玻碳电极作为工作电极，铂丝为对电极，Ag/AgCl（饱和KCl）为参比电极；循环伏安测定在CHI832电化学工作站(美国)上进行，交流阻抗测定在VMP2电化学工作站(美国)，SECM实验在CHI900扫描电化学显微镜(美国)上完成，Branson200超声清洗仪(美国)；pHS-3C型酸度计(上海)； 石英管加热式自动双重纯水蒸馏器(1810B，上海亚太技术玻璃公司)，玻碳电极的直径是3.5mm。

2.3 实验方法

2.3.1 DNA自组装多层膜修饰电极的制备

首先将玻碳电极分别用 0.1和0.05µm 的抛光粉抛光，然后放入超声清洗器中分别用二次水和丙酮清洗5分钟，用氮气吹干；该电极交替的浸入带正电荷的聚乙烯亚胺溶液（3mg/L,包含0.5mol/LNaCl）和带负电荷的dsDNA溶液（1mg/L,在20mmol/LpH=7.1的tris盐酸缓冲液中包含0.5mol/LNaCl和1mmol/L的EDTA溶液）分别10分钟，交替吸附到电极表面，中间用二次水冲洗,形成一层膜即{dsDNA/PEI}膜。根据预先设计的膜层数重复以上操作次数就可以获得需要的多层膜{dsDNA/PEI}n，其中n代表膜层数。图2是成膜过程的示意图。每次在吸附了dsDNA的一步后就进行交流阻抗测试。

图2 自组装dsDNA多层膜在玻碳电极表面的构造示意图

2.3.2 交流阻抗实验

交流阻抗实验中，以1mmol/L K3Fe(CN)6为氧化还原探针，0.1mol/LKCl为支持电解质。测量Fe(CN)63-/4-在氧化还原电对的式电势(＋0.225)下进行，所施加的交流信号的振幅为5.0mV，频率范围为100KHz-0.1Hz。

2.3.3 差示脉冲实验

差示脉冲实验在5mL电解池中进行。工作电极为裸玻碳电极、{dsDNA/PEI}2膜修饰电极。铂电极为对电极, Ag/AgCl (饱和 KCl)为参比电极。测试前需向电解质溶液中通氮气10min以上，除去溶液中的溶解氧。

2.3.4 实验规程

差示脉冲实验用于实验条件的优化和检测DNA的损伤；阿霉素吸入{dsDNA/PEI}2膜是通过浸泡{dsDNA/PEI}2膜电极在20µmolL-1阿霉素缓冲溶液（pH= 7.0, 含 0.1 M NaCl）搅拌至少2小时直到吸入平衡或稳定态。吸入阿霉素最多状态的膜就指定为{dsDNA/PEI}2-ADM膜，将{dsDNA/PEI}2-ADM膜用磷酸缓冲溶液清洗并用氮气吹干后，放入磷酸缓冲溶液进行DPV扫描。{dsDNA/PEI}2-ADM膜在这一阶段的状态就定义为状态I，在状态I的DPV峰电流就指定为Ip,I。然后把状态I的{dsDNA/PEI}2-ADM膜浸入磷酸缓冲溶液一整夜，使尽可能多的ADM从膜里释放出，在这一状态的{dsDNA/PEI}2-ADM膜就定义为状态II，同样将状态II的{dsDNA/PEI}2-ADM膜放入磷酸缓冲溶液进行DPV扫描。

对于DNA损伤实验，状态II的{dsDNA/PEI}2-ADM膜放入9.76mL醋酸盐缓冲溶液（pH 5.5）包含240µL环氧苯乙烯，在37℃下搅拌一定的时间后，取出用水洗，损伤的膜又浸入20µmol·L-1 ADM溶液至少2小时为了再吸入ADM进入膜达到稳定状态。损伤{dsDNA/PEI}2-ADM膜在这一状态就定义为状态III，将状态III的{dsDNA/PEI}2-ADM膜放入磷酸缓冲溶液进行DPV扫描，在状态III的DPV峰电流就指定为Ip,III。每一个修饰电极只能做一次检测，每次检测至少重复三次。图3是阿霉素“吸入/释放/再吸入”DNA层层膜的程序示意说明和对应的DPV检测图（注意：环氧苯乙烯是一种可疑致癌物质并且容易挥发。所有的反应都在密闭的装置进行）

图3.阿霉素“吸入/释放/再吸入”DNA层层膜的程序示意说明和对应的DPV检测图:

3.结果和讨论

3.1 交流阻抗表征{dsDNA/PEI}n层层膜

图4所示为以Fe(CN)63-/4-为探针，裸玻碳和{dsDNA/PEI}n修饰电极（n=1, 2, 3, 4）的交流阻抗图（Nyquist）。实验结果表明，在裸玻碳电极上，探针分子Fe(CN)63-/4-的阻抗图谱在所有频率范围内基本是一条直线，说明了Fe(CN)63-/4-容易到达电极表面发生反应，电极上不存在阻挡电子传递的物质，Fe(CN)63-/4-（4-a）。图4-b, c, d, e各曲线依次代表{dsDNA/PEI}n/GCE （n = 1, 2, 3, 4层）时的阻抗行为。从图可看出,随着组装层数的增多,在高频部分半圆的直径逐渐增大,这表明膜层对电子的阻碍作用增强,探针分子Fe(CN)63-/4-难以通过膜层孔隙到达电极表面。而在低频部分,Warburg 阻抗逐渐减小,从而表明整个过程随层数增加逐渐为动力学所控制。在本实验体系中,因为电极表面修饰一层DNA/PEI膜后，Fe(CN)63-/4-的电荷传递电阻Rct显著增大。这个现象充分说明DNA已被静电吸附在固定了PEI的玻碳电极表面，电极表面大量带负电荷的DNA 阻碍了探针分子的电子传输，从而引起了Rct的增大。

另外，随膜层数增加, 电荷传递电阻（Rct）与膜层数之间显示出很好的线性规律。证明该多层膜随层数增加具有均匀增长、结构致密等特性。

图4 交流阻抗Nyquist图: a，裸玻碳电极; b, c, d, e各曲线依次代表{dsDNA/PEI}n /GCE ( n = 1, 2, 3, 4 层)时的阻抗行为。

3.2 最适宜膜层的选择

图5不同层数的膜充分吸入阿霉素分别形成{dsDNA/PEI}n-MB膜（n= 1, 2, 3, 4层）在磷酸缓冲溶液DPV扫描的峰电流比较。理论上，随着层数n的增加，{dsDNA/PEI}n膜将会有更多活性中心和大量的表面积。但是，图5表明1至4层膜修饰电极中实验结果2层膜修饰电极最大的DPV响应。原因是随膜层数增加电荷传递电阻Rct显著增大（图4），阻碍了物质的扩散，影响探针分子的电子传输。因此，在实验中选择两层膜作为最适宜的膜。

图5 不同层数的膜充分吸入阿霉素分别形成{dsDNA/PEI}n-ADM膜（n= 1, 2, 3, 4层）在磷酸缓冲溶液DPV扫描的峰电流比较。每一个修饰电极只能做一次检测。

3.3 阿霉素在{dsDNA/PEI}2膜中的吸入与释放

通过静电吸引{dsDNA/PEI}2膜组装在玻碳电极表面，首先对阿霉素吸入{dsDNA/PEI}2膜与阿霉素吸附在裸玻碳电极上的DPV行为进行研究。具有芳香杂环和带正电荷的阿霉素分子通过静电的、疏水的相互作用被吸附在玻碳电极表面，当裸玻碳电极浸在阿霉素溶液中2小时，达到吸附平衡。形成MB-吸附- GCE，指定为MB-GCE。然后把MB-GCE放入磷酸缓冲溶液进行DPV扫描，在-230mV阿霉素有一个电流峰出现（图6a）。这证实阿霉素强烈地吸附在玻碳电极的表面。对{dsDNA/PEI}2-ADM膜，在-230mV有一个更高的电流峰（图6b）,认为阿霉素吸入膜的内部。DPV的峰电流在{dsDNA/PEI}2浸入阿霉素溶液达到吸附平衡、稳定态2小时之前是非线性增加。阿霉素与DNA之间强烈的作用，特别是阿霉素嵌入双链DNA的碱基对之间，阿霉素吸入{dsDNA/PEI}2膜中dsDNA起了关键作用。

当充分吸入阿霉素的{dsDNA/PEI}2-ADM膜放入磷酸缓冲液（pH 7.0）中，随着浸泡时间的增加DPV响应减小（图7），表明吸入膜中的一些阿霉素逐渐从膜释放出进入缓冲液，与开始的DPV峰电流相比，浸泡40分钟以后保持在膜中的阿霉素剩大约50﹪。即使浸泡10小时以后，还保持开始的DPV峰电流高的24﹪。然后随着浸泡时间的增加DPV峰电流的减小就变得很慢。

图6 电极在磷酸缓冲液（pH 7.0）中的DPV响应：

图7 {dsDNA / PEI}2-ADM膜在磷酸缓冲液（pH 7.0）中的浸泡时间对DPV峰电流(Ip)的影响

阿霉素在{dsDNA/PEI}2膜中的吸入与释放时可逆的。阿霉素吸入{dsDNA/PEI}2膜到达稳定态之后，{dsDNA/PEI}2-MB膜电极立即浸入磷酸缓冲液（pH 7.0）进行DPV测试（图8a,状态I），然后该膜放入磷酸缓冲液里过夜使尽可能多的阿霉素从膜里释放出来，在这一状态对{dsDNA/PEI}2-MB膜进行DPV测试（图8b,状态II），峰电流有很大的减小。随后，阿霉素吸入{dsDNA/PEI}2膜是通过{dsDNA/PEI}2膜电极再浸泡在20µM阿霉素缓冲溶液（pH=7.0）2小时直到再吸入阿霉素达到稳定态。这时的DPV响应(Fig.8c)与状态I的DPV响应（图8a）相比峰位置和峰高几乎是相同的，表明阿霉素吸入与释放从{dsDNA/PEI}2膜中是十分可逆的，这种良好的可逆性证明{dsDNA/PEI}2在玻碳电极表面不但是稳定的而且保持他们最初的结构和结合能力。

图8 {dsDNA / PEI}2-ADM膜在磷酸缓冲液（pH 7.0）中的DPV响应

3.4 检测环氧苯乙烯（SO）对天然DNA损伤

利用阿霉素作为电活性指示剂并且吸入dsDNA多层膜来检测环氧苯乙烯（SO）对天然DNA的损伤。把状态II 的{dsDNA/PEI}2-ADM膜在环氧苯乙烯（SO）溶液中37℃下温浴并搅拌一定时间。然后取出用水洗，再浸入阿霉素溶液重新吸入阿霉素直到稳定状态。这个重新吸入阿霉素的膜电极立即放入磷酸缓冲液（pH 7.0）进行DPV测试（状态III）。图9是处于状态III的{dsDNA/PEI}2-ADM膜在环氧苯乙烯（SO）溶液中温浴不同时间的差示脉冲图。从图中可以看出，随着温浴时间的增加峰电流减小。

说明损伤的dsDNA多层膜再吸入阿霉素不能达到未损伤的dsDNA多层膜吸入阿霉素同样的水平。阿霉素这种独特的可逆吸入能最大限度地消除阿霉素从膜中的漏泄，通过差示脉冲能灵敏的检测DNA在{dsDNA/PEI}2中的损伤。例如，在环氧苯乙烯（SO）溶液中温浴5分钟的条件下，将会导致处于状态III的{dsDNA/PEI}2-ADM膜的峰电流明显减小（图9）。

图9 处于状态III的{dsDNA/PEI}2-ADM膜在环氧苯乙烯（SO）溶液中温浴不同时间的差示脉冲图。

通过峰电流的比率（Ip,I/Ip,III）与膜在环氧苯乙烯（SO）溶液中温浴时间的斜率可以测定DNA在{dsDNA/PEI}2膜中的损伤率（图10），其中，Ip,I和Ip,III分别是{dsDNA/PEI}2-ADM膜在状态I和状态III的DPV峰电流。在这一实验中，每个膜电极从状态I到状态III只能循环使用一次。为了保证膜电极变化的真实性，必须使用新制成的膜电极重复实验。用相对峰电流的比率（Ip,I/Ip,III）代替绝对峰电流是为了有效的测定DNA的损伤。相对峰电流的比率（Ip,I/Ip,III）随着在环氧苯乙烯（SO）溶液中温浴时间5-30分钟线性增加，损伤率为0.024 min-1，相关系数为0.9972, 证明了我们建立在以阿霉素作为电活性指示剂与DNA层层膜相结合的基因毒性传感器可以有效地检测DNA损伤。

通过以上的方法检测DNA的损伤可能是由于环氧苯乙烯（SO）与DNA形成共价加合物[9]，这些加合物是SON7-鸟嘌呤和 SO-N3-腺嘌呤[5,6]。SO-N7-鸟嘌呤和 SO-N3-腺嘌呤几乎不影响DNA的构造[7,8]。因而，损伤的{dsDNA/PEI}2-ADM膜在状态III DPV峰电流减小，这种现象最可能归因于在损伤的DNA中形成SO-N7-鸟嘌呤和SO-N3-腺嘌呤加合物，这些加合物嵌入DNA邻近的碱基或通过沟槽作用结合在DNA小沟区产生空间阻碍，阻止阿霉素与DNA的结合。随着在环氧苯乙烯（SO）溶液中温浴时间达到30分钟，大量的SO-加合物形成。将导致状态III的膜的DPV峰电流减小，峰电流的比率（Ip,I/Ip,III）增加，在温浴时间超过40分钟后，N7-鸟嘌呤和 SO-N3-腺嘌呤加合物易于脱腺嘌呤化产生脱腺嘌呤位点[6]，结果峰电流的比率变化很小。

图10.峰电流的比率（Ip, I / Ip, III）与{dsDNA/PEI}2-ADM膜在环氧苯乙烯（SO）溶液中温浴时间的斜率图。其中，Ip,I 和 Ip,III分别是{dsDNA/PEI}2-ADM膜在状态I和状态III的DPV峰电流。

4.结论

本研究主要利用带负电荷的DNA为聚阴离子与聚乙烯亚胺（PEI）阳离子通过连续的静电吸附组装成DNA多层膜在玻碳电极表面。并利用电化学交流阻抗技术对这种新型电极表面修饰的DNA自组装多层膜进行表征,证明该多层膜随层数增加具有均匀增长、结构致密等特性。通过差示脉冲（DPV）检测两层膜在实验中是信号最强的，作为最优膜使用。以阿霉素作为电活性指示剂吸入{dsDNA/PEI}2膜来检测环氧苯乙烯（SO）对天然DNA的损伤。以阿霉素在DNA多层膜可逆吸入为基础，这种独特的可逆吸入模式，能显著区分阿霉素在损失和未损失DNA多层膜中的吸入量，并且将阿霉素从膜中的漏泄减小到最小。当阿霉素嵌入双链DNA时，阿霉素主要经过嵌入作用和沟槽作用与DNA结合。环氧苯乙烯（SO）对DNA的损伤可能是由于与DNA形成共价加合物，这些加合物几乎不影响DNA的构造因而，损失的{dsDNA/PEI}2-MB膜在状态III DPV峰电流减小，这种现象最可能归因于在损伤的DNA中形成SON7-鸟嘌呤和 SO-N3-腺嘌呤加合物，这些加合物嵌入DNA邻近的碱基或通过沟槽作用结合在DNA小沟区产生空间阻碍，阻止阿霉素与DNA的结合。为DNA的化学损伤提供一个普遍的、灵敏的检测方法，对于评估食品污染物质的行为具有重要的意义。