防腐生肌膏对基质金属蛋白酶变化的影响

李叔洪，姜晓文，辛 秀，于文会

(东北农业大学动物医学学院，黑龙江哈尔滨 150030)

创伤愈合是一个复杂的过程[1]。创面愈合过程中，迁移增生的平滑肌细胞和成纤维细胞，分泌的细胞外基质起到重要作用，它可以为细胞提供移动的网络和向导，把细胞黏附在一起，对组织的愈合起到骨架作用，并且影响各种生长因子生物活性及其调节作用[2]。Ⅰ型胶原是细胞外基质的重要成分之一，主要起到支架的作用，与皮肤的张力大小有关，Ⅲ型胶原则决定胶原纤维的直径的大小和弹性的好坏[3]。Ⅲ型胶原含量越高、越细，弹性越好，形成的瘢痕越轻，所以提高Ⅲ型胶原的比例，对于创伤愈合质量是很重要的[4]。

基质金属蛋白酶(matrix metalloproteinases,MMPs)是一个需要Ca2+、Zn2+等金属离子作辅助因子的大家族，目前MMPs家族已分离鉴别出20多个的成员，分别为MMP1-20等[5]，其主要生理作用是降解细胞外基质。在创伤愈合的早期，MMPs可以降解细胞外基质中的胶原肽段，并产生趋化因子，加速炎性细胞的吞噬作用，对于炎性反应区的清洁有着重要的作用[6]。其中，MMP-1和胶原有密切的相关性[7]，可以分解创面胶原，减少创面胶原的大量表达聚集，使胶原的合成和分解处于平衡状态，特别是对创面Ⅰ、Ⅲ型胶原的降解起关键作用，在创面愈合中组织重塑阶段起到极其重要的作用。MMP-2在酶解细胞间基质成分及基底膜的主要成分Ⅳ型胶原中有“钻头”的作用，在创伤愈合早期瘢痕组织、肉芽组织形成中发挥作用。MMP-9也称为明胶酶B，它可参与创伤修复过程的几个早期步骤，参与细胞外基质的降解，对Ⅰ型前胶原的合成物有明显的影响，在促进创伤愈合中主要起到延长组织重塑的作用[8]。基质金属蛋白酶抑制剂(tissue inhibitor of matrix metalloproteinases，TIMPs)是MMPs的内源性特异性抑制因子,有4种类型，分别为TIMP-1、TIMP-2、TIMP-3和TIMP-4。其中，TIMP-1可以特异性地与MMP-1和MMP-9结合从而抑制其表达[9]，TIMP-2是MMP-2的特异性抑制剂，可以有效的抑制MMP-2的活性[10]，这种相互作用在创伤愈合的过程中促进了创面组织中胶原的降解，防止创面胶原过度沉积导致瘢痕形成[11-12]。

防腐生肌膏是由血竭、乳香、没药、紫草、三七等中药组成制备的油膏。本方是在传统防腐生肌散原方的基础上，经过筛选、优化制备而成的外用治疗创伤愈合的膏剂。本试验就是应用制备好的防腐生肌膏作用于大鼠的皮肤破损模型，观察防腐生肌膏对创面肉芽组织中基质金属蛋白酶及其组织抑制剂表达量的测定，来阐明防腐生肌膏在创伤愈合过程中的作用机理。

1 材料与方法

1.1 材料

SD大鼠50只，雌雄各半，体重200 g±20 g，购自哈尔滨汉方实验动物繁殖中心；防腐生肌膏主要由血竭、乳香、没药、三七、紫草、黄柏、冰片(哈尔滨市药材公司产品)组成，由东北农业大学中兽医学实验室制备；大鼠MMP-1 ELISA试剂盒、大鼠MMP-2 ELISA试剂盒、大鼠MMP-9 ELISA试剂盒、大鼠TIMP-1 ELISA试剂盒、大鼠TIMP-1 ELISA试剂盒，上海北诺生物科技有限公司产品。

1.2 方法

1.2.1 动物皮肤缺损模型的制备及给药方法 健康SD大鼠50只，常规饲养，7 d后开始造模。造模前用犬眠宝麻醉大鼠，麻醉后的大鼠俯卧固定，背部正中左右两侧距脊柱1 cm处各选择1块5 cm×5 cm的完整皮肤，100 g/L硫化钠脱毛处理，生理盐水清洗擦干局部涂抹碘酊进行消毒，选用自体对照法，在大鼠背部设定皮肤右侧为防腐生肌膏组，左侧为空白对照组，在脱毛处剪成2 cm×2 cm的伤口，深达肌筋膜，大鼠分笼进行饲养，并给以充足的水和食物。防腐生肌膏组的创面每天进行常规消毒，涂抹防腐生肌膏，厚度约2 mm，每天1次，至完全愈合；空白对照组的创面每日常规消毒，涂抹20 g/L碘酊[13]。

1.2.2 样品采集 造模后第3、7、10、14天，随机选取每组各10只大鼠取样，使用乙醚麻醉，剪刀剪取大鼠创面中心至创缘正常皮肤间的新生的肉芽组织部分，约0.5 cm2，置-80℃冰箱中保存。

1.2.3 检测指标及方法 将采集的样本与PBS 1∶9进行研磨，3 000 r/min离心20 min，取上清，分装后置于-20℃备用。采用ELISA检测上清中的 MMP-1、MMP-2、MMP-9、TIMP-1、TIMP-2的含量，重复3次[14]。

2 结果

2.1 防腐生肌膏对创面组织表达MMP-1调节

创伤后第1天，防腐生肌膏组与对照组创面都开始表达MMP-1，两组比较差异不显著(P>0.05)。创伤后第3天，防腐生肌膏组创面MMP-1的表达量最高，与对照组差异显著(P<0.05)。创伤后第7天、第10天、第14天，随着创伤时间延长表达量逐渐减弱，且防腐生肌膏组创面MMP-1表达量极显著高于对照组(P<0.01)(图1)。

与对照组相比较，**代表差异极显著(P<0.01)，*代表差异显著(P<0.05)

** represents extremely significant difference (P<0.01),* shows significant difference (P<0.05),compared with the control group

图1防腐生肌膏对创面MMP-1表达的影响

Fig.1 Effect of Fangfu Shengji ointment on the expression of
MMP-1 in the wound

2.2 防腐生肌膏对创面组织表达MMP-2调节

创伤后第1天，防腐生肌膏组与对照组开始表达MMP-2，两组差异不显著；创伤后第3天、第7天防腐生肌膏组创面MMP-2表达量逐渐增加，第10天达到高峰，之后开始减弱；创伤后第10天、第14天，表达量与对照组比较差异极显著(P<0.01)(图2)。

与对照组相比较，**代表差异极显著(P<0.01)

** represents extremely significant difference (P<0.01)

图2防腐生肌膏对创面MMP-2表达的影响

Fig.2 Effect of Fangfu Shengji ointment on the expression
of MMP-2 in the wound

2.3 防腐生肌膏对创面组织表达 MMP-9 调节

创伤第1天，防腐生肌膏组与对照组都开始表达MMP-9，随着创伤时间延长，在创伤后第3天达到表达高峰，之后逐渐减弱。防腐生肌膏组与对照组比较，防腐生肌膏能极显著促进创面表达MMP-9(P<0.01)(图3)。

2.4 防腐生肌膏对创面组织表达 TIMP-1 调节

创伤开始后，创面就开始表达TIMP-1，随着创伤时间延长，防腐生肌膏组与对照组比较，TIMP-1的表达量逐渐减少，并且极显著低于对照组(P<0.01)(图4)。

与对照组相比较，**代表差异极显著(P<0.01)

** represents extremely significant difference (P<0.01)

图3防腐生肌膏对创面MMP-9表达的影响

Fig.3 Effect of Fangfu Shengji ointment on the expression
of MMP-9 in the wound

与对照组相比较，**代表差异极显著(P<0.01)

** represents extremely significant difference (P<0.01)

图4防腐生肌膏对创面TIMP-1表达的影响

Fig.4 Effect of Fangfu Shengji ointment on the expression
of TIMP-1 in the wound

2.5 防腐生肌膏对创面表达 TIMP-2 调节

创伤开始后，创面就开始表达TIMP-2，随着创伤时间延长，防腐生肌膏组与对照组比较，TIMP-2表达量逐渐减少，并且极显著低于对照组(P<0.01)(图5)。

与对照组相比较，**代表差异极显著(P<0.01)

** represents extremely significant difference (P<0.01)

图5防腐生肌膏对创面TIMP-2表达的影响(ng/mL)

Fig.5 Effect of Fangfu Shengji ointment on the expression
of TIMP-2 in the wound(ng/mL)

3 讨论

创伤发生后，肉芽组织的快速生长能够促进创伤愈合。肉芽组织主要成分为胶原，主要包括Ⅰ型胶原和Ⅲ型胶原。基质金属蛋白酶和基质金属蛋白酶抑制调控胶原剂的合成与分解。因此，在创伤修复过程中，基质金属蛋白酶和基质金属蛋白酶抑制在组织中的含量变化，体现了胶原在创口中的积累，代表创口填充的快慢。在创伤修复中，基质金属蛋白酶MMP-1、MMP-2、MMP-9促进胶原的分解，而基质金属蛋白酶抑制剂TIMP-1、TIMP-2抑制基质金属蛋白酶的活性。因此，检测MMP-1、MMP-2、MMP-9与TIMP-1、TIMP-2含量变化，可以推知胶原在伤口的积累情况。

试验结果显示，创伤第1天，防腐生肌膏组与对照组创面都开始表达MMP-1、MMP-2、MMP-9及TIMP-1、TIMP-2，这主要是因为创伤早期成纤维细胞及各种炎性细胞开始分泌一定量的MMP和TIMP，目的为抑制早期的炎症反应。随着创伤时间的延长，创伤后第3天，防腐生肌膏组创面MMP-1的表达量达到最高，之后表达量逐渐减少；MMP-2的表达量随创伤时间逐渐增加，第10天达到高峰，之后开始减弱；MMP-9的表达量创伤后第3天达到表达高峰，之后逐渐减弱。从三者的表达量看，防腐生肌膏组均高于对照组，且差异显著。研究发现，血竭中的血竭素高氯酸盐对瘢痕成纤维细胞的增殖具有显著的抑制作用，且呈剂量依赖性降低Ⅰ、Ⅲ型前胶原的表达而抑制成纤维细胞合成胶原促进成纤维细胞发生凋亡[15]。血竭为防腐生肌膏中的主要药物，试验中防腐生肌膏通过提高MMP-1、MMP-2及MMP-9的表达促进Ⅰ、Ⅲ型胶原降解来调节创面愈合防止瘢痕组织形成的结果相一致。Krieglstein C F等[16]研究发现，对试验性肠炎模型的SD大鼠，乳香提取物和11-羰基-β-乙酰乳香酸单体均可以明显减轻组织损伤程度，具有抗炎作用。组方中乳香、没药的配伍从中医理论的角度理解，其所涵盖的药物相互作用表现为同气相求，现代研究也发现，两药配伍的药效作用通常呈现为药理作用的协同增效[17]。另外，方中紫草的活性成分也具有抗炎作用[18]。而方中三七中的活性成分对瘢痕成纤维细胞增殖有抑制作用[19-20]，缩小瘢痕组织，提高伤口愈合质量。防腐生肌膏方中诸药的共同作用下，调节胶原代谢，促进组织愈合，减少瘢痕产生。

防腐生肌膏能通过促进创伤愈合的一个重要机制是通过调控MMP-1、MMP-2、MMP-9与TIMP-1、TIMP-2的活性，调节胶原代谢，促进创伤愈合。